آماده سازی محیط کشت

3-1 ترکیبات محیط کشت

بطور آشکار محیط کشت غذایی عامل مهم در کشت بافت و سلول بشمار می آید، البته برای هر کدام از گونه های درختی آزمایش های فاکتوریل که در آنها کلیه مواد شیمیایی محیط کشت در طیف وسیعی از غلظت های متغیر باشند، انجام نگرفته است. برای انجام چنین تحقیقی به امکاناتی بیش از آنچه که در اکثر آزمایشگاهها موجود است نیاز می باشد.

 آنچه که طراحی محیط کشت را بطور خاصی مشکل می کند، اثرات متقابل بسیار پیچیدة مواد شیمیایی مختلف در یک محیط کشت غذایی مشخص می باشد. بعنوان مثال کاربرد بعضی از قندها ر محیط کشت سبب کمبود بر می شود. پیچیده تر از آن ا حالتی است که بر بیش از حد نیاز وجود داشته باشد در این حالت نیاز بافت به کلسیم کاهش خواهد یافت. به دلیل وجود چنی اثر متقابلی، تعیین ترکیبات مطلوب محیط کشت از طریق آزمایشهای فاکتوریل مشکل است. از طرفی این وضعیت با درنظر گرفتن این حقیقت که اثرات متقابل بین بافت و مواد غذایی تحت تأثیر شرایط محیطی از قبیل شدت و کیفیت نور، دورة نوری، درجه حرارت، آگار یا مایع بودن محیط کشت، PH، و غیره قرار می گیرند پیچید تر می گردد. بعلاوه عکس العمل بافت با تغیر وضعیت فیزیولوژیکی ریز نمونه با بافتی که واکشت شده فرق می کند.

 محیط کشت های اولیه که در کشت بافت بکار می رود محلول های غذایی تغییر یافته کشت آبکشت گیاهان بود( محلول های غذایی ناپ، ففر و هوگلند-  جورج و شرینتگتن) به این مواد مخلوطی از اسیدهای آمینه، ویتامینها و سایر ترکیبات آلی اضافه می شد. امروزه اکثر کشتهایی که استفاده می شوند نوع تغییر یافتة محیط های قدیمی هستند با بررسی فهرستی مشتمل بر 260 محیط کشت بافت گیاهی تنها 39  محیط کشت دارای ترکیبات پایه بودند محیط کشت موراشی و اسکوک (MS )[1]بین سایر محیط کشت های گیاهی بیشترین کاربرد را دارد. از میان محیط کشت های ذکر شده توسط جرج و شرینتگتن، 53  محیط کشت از نظر فرمول عناصر پرمصرف مشابه محیط کشت MS بودند ولی در قسمت های دیگر تفاوت داشتند.

 اکثر محیط  کشت ها از طریق آزمون و خطا بتدریج بهبود یافته اند. البته در برخی از محیط کشت ها روش تجربی کمتر بکار رفته است. مقدار مواد معدنی موجود د محیط  کشت MS  براساس تجزیه خاکستر بافت توتون سوزانده شده می باشد. محیط کشت LM که اغلب برای سونی برگها استفاده می شود براساس تجزیة ترکیب شیمیایی آرکگونهای بذر نابالغ Pseudostsuha menziesii  است البته هیچ گونه تضمینی وجود ندارد که این محیط کشت ها برای تمام ژئوتیپ ها مطلوب باشند یا اینکه چنین تجزیه شیمیایی برای تمام انواع بافتهای گونه های مختلف انجام شده باشد. محیط کشت موردنیاز جهت رشد کالوس نسبت به محیط کشت برای ایجاد و رشد ساقه بایستی دارای مواد معدنی با غلظت بیشتری باشد در حالیکه محیط کشت موردنیاز جهت ایجاد و رشد ریشه فرق می کند محیط کشتی که برای کشت پروتوپلاست بکار می رود اغلب با محیط کشتی که برای پروتوپلاست استفاده می شود بطور کامل تفاوت دارد. از طرف دیگر گونه هایی وجود دارد که درطیف وسیعی از محیط کشت های بخوبی رشد می کنند؛ یعنی محیط کشتهای مطلوب و مشخصی برای اینها وجود ندارد. همچنین حالت هایی و جود دارند که در آنها تهیه یک ژئوتیپ مناسب از تهیه یک محیط کشت مطلوب و دقیق مهمتر است. چنین حالتی برای جنس Populus وجود دارد. بعضی از ژئوتیپهای این جنس روی محیطهای آزمایش شده خیلی ضعیف رشد می کنند در برخی از گونه ها هر رقم دارای نیازهای غذایی مخصوص به خود است.

 جرج و همکاران براساس مواد تشکیل دهنده، محیط کشت بافتهای گیاهی را به چهار دسته عمده، عناصر پرمصرف، عناصر کم مصرف، ویتامینها و اسیدهای آمینه یا آمیدها تقسیم کرده اند. برخی از محیط کشت ها مانند وایت، موراشی واسکوگ، گامبور و همکاران(B5 ) لیتوی و لوید و مک کاون محیط کشت های پایه[2]  یا تقریباً پایه هستند. بسیاری از محیط کشتهای مورد استفاده دیگر آنهایی هستند که در اثر تغییر کلی یا جزئی محیط کشت های پایه حاصل شده اند.

 عناصر پرمصرف محیط کشت موراشی و اسکوگ اغلب در حد یا  غلظت محیط پایه رقیق می شوند به همین ترتیب چنین کاری در سایر محیط کشت ها که غلظت عناصر در آنها بالاست انجام می گیرد.

 علاوه بر طبقه بندی محیط کشتهای ذکرشده در بالا محیط کشتها را می توان به دو حالت مایع و جامد نیز تقسیم کرد. در حالت جامد محیط دارای عامل ژله کننده است که بافت کشت شده را روی سطح محیط نگه می دارد. این محیط کشتها همچنین درای ویتامینها، اسیدهای آمینه، تنظیم کننده های رشد کربوهیدراتها و اغلب سایز مواد تشکیل دهنده موردنیاز نیز هست.

 3-1-1 عوامل تولیدکنندة ژل و جایگزینی آنها

3-1-1-1 آگار و دیگر مواد تولید کننده ژل

آگار از رایجترین عامل تولید ژل است که در محیط کشت استفاده می شود. آگار پلی ساکاریید هایی پیچیده است که از برخی گونه های نوعی علف هرز دریایی بدست می آید آگار طی مراحل ساخت در جات متفاوتی از خلوص را طی میکند. ولی مقداری ناخالصیهای آلی و معدنی در آن باقی می ماند. دیفکوباکتوآگار از رایجترین آگار مصرفی در کشت بافت است که دارای مقدار زیادی سدیم و مس می باشد. میزان سدیمی که از طریق آگار در محیط کشت وارد می شود براحتی توسط بافت اکثر گیاهان تحمل می شود. اما گاهی اوقات مس در محیط کشت ایجاد سمیت می کند. محققان اغلب آگار را در غلظت های بین 5/0 و 1 درصد بکار می برند غلظت مناسب آگار برای هر نوع محیط کشت ریز نمونه باید تعیین شود. غلظت خیلی  بالای آن منجر به تنش آب در بافت می شود و غلظت های کم آن یک لایه مایع روی سطح ژله تشکیل خواهد داد و غرق شدن ریزنمونه در این لایه مایع مانع از مبادلات گازی شده و به کاهش رشد منجر می شود. بعلاوه کشت ریزنمونه روی محیط کشت مایع می تواند باعث شیشه ای شدن[3] کشتها شود علیرغم آنچه بیان شد بعضی از کتشها روی محیط با غلظت کم آگار رشد بهتری دارند. بعنوان مثال ماده خشک در نوک شاخه های Picea obies در حیط کشت با غلظت آگار 125/0 % نسبت  به غلظت 1% سریع تر تجمع می یابد. این ممانعت در غلظت بالای آگار احتمالاً مربوط به تجمع سریع فرآورده های زاید( اینورتاز) در سطح زیرین نمونه است و در میحط با غلظت کم آگار ممکن است به دلیل اینکه میزان انتشار مواد به اندازه کافی وجود داشته از بروز چنین حالتی جلوگیری شده باشد. انواع متداول آگار در دمای بیش از 40  در جه سانتیگرا تشکیل ژل می دهند. میزان سختی ژل به PH محیط کشت بستگی دارد.  از محیط کشت های تغییر یافته رینرت و ایت با 5/0 آگار برای کشت بافتهای شیمر Picea glouca استفاده شده است. در PH 5/5 محیط کشت کاملاً سفت بود، در صورتی که در PH های 4 یا 5/4 برای نگهداری بافت، محیط کشت بسیار نرم بود. اخیراً کارهای خالص تری عرضه شده که در درجه حرارت پائین تر تشکیل ژل می دهد . محیط کشت بسیار نرم بود، در صورتی که در PH های 4 یا 5/4 برای نگهداری بافت محیط کشت بسیار نرم بود. اخیراً کارهای خالص تری عرضه شده که در درجه حرارت پائین تشکیل ژل می دهند. از این ژل ها می توان برای تثبیت پروتوپلاستها و یا تک سلولی ها درون یک شبکه استفاده کرد ولی به دلیل قیمت بالای آنها، کاربرد آنها محدود به آزمایش های کوچک است.

 تصور می شود آگار دارای توانایی جذب مواد است که این توانایی می تواند در حذف مواد زاید سلولی از محیط کشت به روشی مشابه زغال نماید. همچنین این خاصیت می تواند مانع جذب برخی مواد شیمیایی به بافت کشت شده شود. یکی از موادی که به دشت توسط آگار جذب می شود سیتوکینین است. بنابراین غلظت بیشتر آگار جذب سیتوکینین از محیط کشت را برای بافت مشکل تر می کند. همچنین گزارش شده آگار در غشای سلولی سبب قطعیت مثبت می شود. اگرچه مدارک موجود متناقض است. تداومم موفقیت آگار در کشت بافت ممکن است مربوط به جذب پیچیده و قابلیت الکتریکی باشد؛ با این حال برخی محققان به دنبال یافتن جانشین های ارزانتر و بهتر برای آگار هستند که اثرات متقابل پیچیدة کمتری با بافت کشت شده نشان می دهد.

 متداولترین جایگزین آگار ژل رایت است. این ماده یک پلی ساکارید پیچیدة خارجی سلولی است که توسط Pseudomonas elodea تولید می شود. ژل رایت زمانی که در حضور کاتیونهای مختلف بخصوص منیزیم و کلسیم حرارت داده شود ژل سختی را تشکیل می دهد. استحکام ژل رایت بین PH 4 تا 7 به مقدار خیلی کم تغییر می کند. بعلاوه ژل رایت به شدت به مقابل تجزیه شدن توسط آنزیم های آزاد شده از میکروبها مقاومت می کند.( همچنین آنزیمهایی که ممکن است از سلولهای گیاهی آزاد شود.) در دمای بین 30-45 درجة سانتیگراد جامد می شود و ذوب آن در دمای بالا یا پائین تر از 100 درجه سانتیگراد بسته به شرایطی که در آن ژل تشکیل می شود انجام می گیرد. ژل رایت نسبت به آگار دارای مواد معدنی آزاد و ناخالصیهای آلی کمتری است. البته دارای غلظت های بالای پتاسیم و منیزیم می باشد تنها مشکل ژل رایت این است که بعضی از کششها در ژل رایت سریعتر از آگار، شیشه ای می شوند. در مطالعه ای بمنظور مقایسة اثر آگار و ژل رایت بر جنین زایی سوماتیکیPican  obits انجام شد مشخص گردید که عکس العمل مشاهده شده در محیط کشت یا 3/1- 7/0 آگار مشابه محیط کشت دارای5/0-2/0 ژل رایت است البته کوتیلدون های Pinus canariensis  روی محیط کشت دارای 8/0 دیفکوباکتو آگار جوانه های بیشتری نسبت به محیط کشت های که دارای غلظت های متفاوت ژل رایت بودند تشکل دادند. در محیط کشتی که توسط آگار، جامد شده باشد به مرور زمان PH کاهش می یابد اما محیط کشت دارای ژل رایت، PH نبات بیشتری دارد. اغلب ژل رایت را همراه با آگار و با نصف غلظت های موردنیاز از هرکدام به کار می برند. به این وسیله از مزایای هر دو  ماده استفاده می شود و معایب آنها نیز کاهش می یابد.

برای جامدکردن محیط کشت از نشاسته های مختلف نظیر نشاسته جو، ذرت، سیب زمینی، و گندم نیز استفاده شده است . این نشاسته ها برخلاف سایر عوامل تولیدکننده ژل می توانند بعنوان منبع کرنبه نیز عمل کنند. بعضی از هیدراتهای کربن که از شکسته شدن آنزیمی نشاست تولید می شوند اندروژنز در بساک برخی از گونه ها را تحریک می کنند درآزمایش ساقه های Betula pendula  روی محیط کشتی که با پالپ سیب، جامد شده بود کشت گردیدند ریشه زایی در این محیط بهتر از محیط کشت حاوی آگار انجام گرفت.

 آلژینات کلسیم غالباً برای محفاظت از بذر مصنوعی و آگاهی برای کشت پروتوپلاست بکار می رود در صورتیکه برای تولید بذر مصنوعی استفاده شود جنینهای سوماتیکی با آلژینات سدیم مخلوط شده و سپس در محلول نمک کلسیم ترکیب می گردند. برای قراردادن سلول های گیاهی در بستر آلژینات، محیط غذایی مایع با آلژینات مخلوط و سوپانسیون سلولی با استفاده از یک سرنگ با فشار در داخل آن قرا داده می شود با استفاده از نازل میتوان این فرآیند را سرعت داد و به سطح مطلوبی برای تولید صنعتی رسانید. آلژیناتی که برای پلیت کردن پروتوپلاست استفاده می  گردد نیز بطور مشابه با اضافه کردن یونهای کلسیم جامد می گردد. مزیت اصلی آلژینات این است که در حرارت اتاق می تواند جامد شود. بنابراین سلول ها یا پروتوپلاستها در هنگام قراردادن در داخل آلژینات متحمل شوک کلسیم را از آلژینات جدا کند مجدداً آن را به مایع تبدیل کرد. با این روش می توان کلنی های رشد کرده حاصل از پروتوپلاستهای تزریقی را بدون اینکه در معرض تنش گسترده ای قرار گیرند، بازیافت کرد. در صورتی  که آلژینات اتوکلاو شود از بین خواهد رفت. برای ضدعفونی کردن می توان آن را به مدت 20 دقیقه در دمای 90 درجه سانتیگراد قرار داد. تک سلولیهای داخل شده در آلژینات را می توان با داخل کردن مجدد آن در پلی آکریب آمید استقرار بیشتری بخشید پلی آکریل آمید در حالت ژله ای خاصیت سمی دارد اما چسبندگی آلژینات در اطراف سلول ها، پوشش مناسبی بمنظرو حفظ سلول ها از این سمیت ایجاد می کند.

 برای کشت پروتوپلاست اغلب آگاروز را بیش از آگار یا آلژینات ترجیح می دهند البته در بعضی مواثع پس از مدتی برای پروتوپلاست ایجاد سمیت می کند کشت پروتوپلاست روی آگاروز از نظر تقسیم آگاروز یا بلوک های قرراگرفته در محیط کشت مایع دارای مزایای متعددی است. کشت پروتوپلاست ها بصورت صفحه ای در جوار یکدیگر در مقادیر کم آگاروز دارای همان شرایط محیط کشت درون آگاروز خواهد بود. وجود مقادیر زیاد محیط کشت مایع در اطراف آگارروز، مواد غذایی ، ضروری را برای آگاروز بطور مداوم فراهم می کند و فرآورده های زیاد تولیدشده توسط پروتوپلاستها با سلولها را دفع می کند. افزون بر این می توان براحتی محیط کشت مایع جدید یا محیطی کشتی را که از نظر ترکیبات شیمیایی تغییر یافته یا حداقل اختلال جایگزین محیط کشت قدیمی نمود. آگاروز درد مقایسه با آگار در دمای کمتری جامد می شود. بنابراین پروتوپلاستها در زمانی که آگاروز نزدیک به جامدشدن است، زنده باقی خواهند ماند. کیفیت آگارزو اغلب در زنده نگهنداشتن پروتوپلاست  مهم است.  آگاروز د کشت سلول هایی که به آگار بسیار حساس هستند نیز بکار می رود.  سلول های کاج(Callitris drummondii ) زمانی که در محیط کشت حاوی آگار با غلظت ه کمی همچون 1/0  قرار گرفتند قادر به تقسیم سلولی نبودند اما در محیط  کشت که با آگاروز جامد شده بود بخوبی رشد کردند.

 3-1-1-2 حمایت کننده های فیزیکی

برخی از بافتهای کشت شدهروی دانه های شیشه ای کوچک که در اثر تماس با محیط مایع هستند بخوبی رشد می کنند. دانه های شیشه ای امکان تخلیه محیط مایع قبلل و اضافه کردن محیط کشت جدید را بدون اینکه خسارتی به ریز نمونه وارد شود، میسر می کنند. این حالت برای زمانی که بافت کشت شده در اثر شرایط نامساعد ترکیباتیس سمی ایجاد می کند یک مزیت محسوب می شود. مزیت دیگر استفاده از دانه های شیشه ای و سایر حمایت کننده های فیزیکی این ست که محیط کشت را می توان با PH پائین نیز  مورد استفاده قرار داد. آگار در PF پائین بطور کامل جامد نمی شود.

 حمایت کننده های دیگر فومهای رزینی فنلی هستند که از آنها برای کشت ساقه های ریشه دارPrunus cerasus استفاده شده است. ریشه ها به دلیل تبادل خوب هوا در داخل ذرات فوم دارای کیفیت خوبی بودند. ساقه های ریشه دار را می توان براحتی در چنین ذراتی منتقل  نمود. نگرانی عمدة کاربرد فوم رزینی فنلی مربوط به زمانی است که نیاز به دفع فوم آلدئید سمی باشد. سلول های Coffea Arabica رادر سطح و داخل دانه های فومی اورتان[4] تثیبت کردند در حالیکه دانه ها در محیط کشت مایع غوطه ور بودند. تعداد سلول های تثبیت شده به تراکم منفاذ فوم بستگی دارد. آزمایشی یا استفاده از مواد جذب کننده مصنوعی یافت نشده در کشتهای یک رقم Musa انجام گرفت. در  کلیه مواد یافته نشده به جز پلی استر رشد بطور مؤثرتری از محیط کشت شاهد که دارای آگار  بود حمایت شد. بهترین رشد در  بدست آمد که یک مصنوع ترکیبی  استانی بود. همچنین از یک لاه پلی استر یافته نشده همراه با یک صفحه کاغذ صافی در قسمت فوقانی جهت حمایت از کشتهای جنینی Picea sitchensis در طی  دوران جنینی استفاده شده است. الیات و تورپلی استر نیز برای کشت پروتوپلاستهای سوزنی برگها و گیاهان چوب سخت بکار رفته است.

 3-2-1 سیستم های کشت مایع در مقابل جامد

در تولید انبوه کشتهای سوسپانسیون سلولی نسبت به کشت در محیط های غذایی جامد ترجیح داده می شوند. رشد در محیط های مایع معمولاً سریعتر است، نیاز کمتری به مراقبت دارد و اتوماسیون آن راحت تر است بعلاوه به دلیل عدم استفاده از عوامل جامدکننده، از مزیت بالا و عدم  خلوص شیمیایی مربوط به تعدادی از اینگونه مواد نیز اجتناب می شود. البته تمام کشتها در محیط کشت مایع رشد خوبی ندارند . افزون بر موارد فوق، شیشه ای شدن مشکلی است که در محیط کشت مایع بروز می کند.

 کشت سوسپانسیونی معمولاً شامل توده های کوچک سلولی و تعداد کمی سلولهای انفرادی است در موارد بسیار نارد سوسپانسیون سلولی ممکن است سلولها کاملاً از یکدیگر مجزا باشند. برای باززایی گیاهچه، وجود توده های سلولی اغلب ضروری است، زیرا ریخت زایی اغلب به تماس سلول به سلول و شیب عوامل شیمیایی داخل توده سلولی بستگی دارد. عامل دیگری که ممکن است در ریخت شناسی کشتهای سوسپانسیون سلولی بعضی گونه ها مؤثر باشند چرخش سلولها و توده های سلولی در محیط مایع است. برای جلوگیری از تغییر مداوم وضعیت سلولها و توده های سلولی داخل محیط دارای جاذبه، می توان از ایجاد یک قطب مناسب در تودة سلولی استفاه کرد این مشکل را می توان یا تثبیت سلول ها در یک وضعیت ثابت داخل محیط کشت مایع یا از طریق پلیت کردن، آنها روی میحط کشت جامد برطرف کرد.

رشد سلول های کاج در کشت سوسپانسیونی اغلب با مشکل همراه است. از 27 لاین سلولی Pinus contora که از کانونهی کشت شده روی محیط جامد به دست آمده بودند. تنها در سه کشت سوسپانسیونی بمدت طولانی زنده ماندند. با وجود این در تعدادی از گونه های سوزنی برگ سوسپانسیونهای سلولی استقرار یافته اند. کشتهای سوسپانسیونی که براحتی رشد کردند آنهایی بودند که از توده های سلولی جنینی حاصل شده بودند. حتی در چنین حالت هایی هم برای رشد مناسب، اغلب اصلاح دقیق محیط کشت اجتناب ناپذیر بوده  است. بعنوان مثال کشتهای سلولی که از توده سلولی جنینی Picea glouca بدست آمده بودند قبل از این که سلول ها در حالت سوسپانسیونی به مراحلی برسند که توانایی تشکیل پروتوپلاست های جنینی داشته باشند، نیاز به اصلاح عناصر پرمصرف در یک طیف بسیار کم داشتند. جایگزینی یک محیط تازه با تغییر یافته بجای محیط کشت موجود می تواند مشکل آفرین باشد. جداکردن سلول های Picea abites از محیط کشت غذایی مایع توسط سانتریفوژ جتی در دور پائین چون  در 10 دقیقه به غیر نرمال شدن جنین زایی در کشت بعدی انجامید. به دلیل اینکه حذف محیط کشت توسط صافی سبب آسیب به سلول های می شود بهترین روش برای خارج کردن سلول ها از محیط کشت، رسوب دادن سلول هاست.

 3-1-3 عناصر پرمصرف

بیشتر اطلاعات مربوط به تغذیه معدنی گیاهان را می توان بررسی های انجام شده در زمینه های دیگری غیر از بافت جمع آوری کرد. بعنوان مثال این اطلاعات را می توان از متون تغذیه گیاهان عمومی بدست آورد.

 بررسیهای انجام شده توسط کلارکسون و هانسون و کتاب مارشنر منابع خوبی برای چنین اطلاعاتی هستند اما در زمان تجزیه و تحلیل آثار مربوط به تغذیه به گیاه نکته ای که باید بدان توجه نمود این است که سازوکار های جذب مواد ریشه در خاک با آنچه سلول ها در شرایط این ویترو عمل می کند، متفاوت است.

 آزمایش های ساده کیفیت بافت نشان می دهند که نیتروژن، پتاسیم، کلسیم، فسفر، منیزیم، و سولفور برای رشد مناسب سلول اهمیت دارند. در آزمایشهای مقدماتی که برای مطالعة رشد ریشه انجام گرفته است از این مواد در غلظت های کم استفاده شد بدنبال آن مشخص شد که بافت کالوس اغلب به غلظت های بیشتری از این عناصر پرمصرف نیاز دارد. در ادامه به توضیح نقش اصلی مواد فوق و سایر عناصر پرمصرف در میحطهای غذایی که برای درختان معرف شده اند، خواهیم پرداخت. برای کسب اطلاعات کلی در زمینه ترکیب شیمیایی محیط کشت های برای گونه های چوبی و  یا سایر گونه ها، خواننده را به نوشته جورج و همکاران ارجاع می دهیم.

 3-1-3-1 نیتروژن

نیتروژن در متابولیسم اسیدهای آمینه و پروتئین ها اهمیت دارد. بنابراین در رشد و تمایز نقش مهمی ایفا می کند. در شرایط طبیعی گیاهان، وجود نیتروژن بر رشد طولی ساقه و شکل ظاهری بنحوی خاص تأثیر می گذارد. در محیط غذایی کشت بافت نیتروژن از طریق نمکهای نیترات وآمونیوم اسیدهای آمینه و فرآورده های آلی و پیچیده نظیر شیرنارگیل و کازئین هیدرولیز شده فراهم می شود.

 نیترات به دیل اینکه به سرعت جذب شده و وارد متابولیسم سلولی می شود یک منبع خوب نیتروژن بحساب می آید. بعلاوه نیترات در محیط کشت غذایی به دلیل اینکه روی تعدادی از فرآیندهای نمو اثر می گذارد دارای اهمیت است. نیترات در بین سایر منابع نیتروژنی می  تواند عامل منشعب شدن ریشه ، شکسته شدن خواب بذر و جوانه و حذف غالبیت انتهایی گردد. کاهش نیتروژن غالباً رشد جنسی را تحریک می کند.

محیطهای کشت که نیترات تنها منبع نیتروژنی است اغلب در طول زمان بیشتر خاصیت قلیایی پیدا می کند. برای کنترل این حالت می توان از مقدار کمی نمک آمونیوم استفاده نمود. بعبارت دیگر اگر بافتی ترجیحاً یون آمونیوم جذب کند PH محیط کاهش می یابد.

 3-1-2-2- کلسیم

کلسیم جزئی  ازدیواره سلولی، غشاها لیگنین است که دارای فعالیت یونی سیتوپلاسمی و تحریک فیزیولوژیکی کمی است در نتیجه میزان تجمع، تعادل بین سلولی و انتقال آن در آوند های چوبی پائین می باشد. یک وظیفه مهم کلسیم حفاظت از غشای سلولی در برابر آسیب و پاره سدن است. بعلاوه کلسیم با تقسیم و بزرگ شدن سلول در ارتباط می باشد. همچنین کلسیم در واکنش های فیتوکرومی نقش داشته و با سنتز دیوارة سلولی که توسط اکسین تحریک می گردد مرتبط است. کلسیم سیتوپلاسمی تنظیم کنندة عمل هورمونها است و به طیف وسیعی از علائم محیطی از قبیل نور و حرارت واکنش نشان می دهد. وجود کلسیم با غلظت بالا در محیط کشت اثرات سوء غلظت بیش از حد  را که باعث عدم جنین زای غیرجنسی می شود خنثی می کند.

 کلسیم به دلیل این که دارای حلالیت کمتری در آب می باشد غلظت آن اغلب در محیط کشئت کم است. جنین حالتی به کمبود کلسیم در بافت کشت شده می انجامد. مشخصه بارز چنین کمبودی نکروزه شدن نوک ساقه است. البته در کشتهای انجام شده   P.deltoides   Pppulus trichocarpa  این مشخصه با کنترل بهتر PH و پائین آوردن پیش از حد معمول دمای محیط برطرف شد.

 3-1-3-3 منیزیم

منیزیم فعالیت کننده آنزیم ها یا محرک عمل آنها پس از شروع فعالیت است. همچنین یک عضو ساختمانی کلروفیل بوده و برای حفظ تمامیت ریبوزوم و اسیدهای نوکلئیک و استحکام غشاها ضروری است.

 منیزیم بشدت با کلسیم و منگنز در تقابل است این عنصر در برخی محیط  کشت های بخصوص محیط کشت لیتوی که برای کاج استفاده می گردد، در سطح بسیار بالایی قرار داد. جذب منیزیم درPH پایین محدود می گردد.

 3-1-3-4 پتاسیم

پتاسیم فراوان ترین کاتیون در سلول است که نقش مهمی در کنترل اسمزی ایفا می کنند. پتاسیم تعدادی از آنزیم های مهم سیتوپلاسم را که برخی از آنها در سنتز پروتئین و گلیکولیز دخالت دارند فعال می کند. پتاسیم سیتوپلاسمی برای حداکثر کردن فعالیت فتوسنتزی، کنترل فرآیند انتقال غشایی و  تنظیم PH سیتوپلاسمی لازم است. در واکوئل پتاسیم نقش مهمی در کنترل فشار تورژسانس دارد. د رگیاهان با کمبود پتاسیم، کاتیونهای نظیر سدیم، منیزیم، و کلسیم می توانند در کنترل تورم سلولی جانشین پتاسیم گردند. در محیط کشیت که بطور مطلوبی بالانس شده، بافت های کشت شده تجمع پتاسیم را پیش از سدیم ترجیح می دهند. در محیط نامتعادل این تمایلات به شدت به جذب سدیم تبدیل می گردد. غلظت پتاسیم در ساقه ها و دربرگهای جوان بیشتر است. جذب پتاسیم با سیتوکینین ها و نور تحریک شه و با ABA محدود می گردد.

 کمبود پتاسیم می تواند منجر به تجمع پلی آمین گردد.

 کشتهای برخی از گونه های درختی به پتاسیم حساس است. در کشت Manihot eaculenta پتاسیم در غلظت 10 میلی مولار که نصف غلظت پتاسیم در محیط کشت MS است. برای رشد ریشه و ساقه مناسب بوده است.

 3-1-3-5 فسفر

فسفر در فسفریلاسیون نوری، مسیر پنتوز فسفات و گلیکولیز یا به عبارت دیگر در چرخه های متابولیکی که به ATP و NADPH مربوط می شود دارای نقش مهم است. فسفر عضو مهم غشاهای بیولوژیکی( در فسفولیپیدها) و اسیدهای نوکلیئک است. در گیاهانی که دارای کمبود فسفر هستند تحرک نشاسته به رگهای آنها خسارت وارد می کند. در چنین گیاهانی نشاسته به مقدار زیاد در کلروپلاستها تجمع می یابد. وجود فسفر در شرایط انکوباتوری در محیط کشتی که دارای سطح بالای فسفات معدنی است مانع سنتز بیولوژیکی اتیلن می گردد. افزایش فسفات در سطحی بیشتر از آنچه که در محیط کشت MS وجود دارد در بعضی مواقع باعث افزایش تولید ساقه و رشد طولی آن می گردد در محیط کشت دارای آگار میزان در اختیاربودن فسفر به دلیل جذاب  توسط آگار کاهش می یابد. تعداد جوانه هایی که توسط ریزنمونه های ساقه Pinus carbaea  تولید گردیدند به مقدار فسفری که توسط ریزنمونه ها مصرف شده بود بستگی داشت. در کشت Acer pseudoplatanus عملکرد نهایی سلول ها تقریباً با سطح فسفات اولیة محیط کشت متناسب بود. در کشتهای یکنواخت فسفاد در پائین تر از 55/0 میلی مول، محدودکنندة رشد بود. سطح مقدار فسفات در کشت Manihot esculenta برای رشد ریشه 4 میلی مول و برای رشد ساقه 2-4 میلی مول بود این غلظت ها بیش از غلظت فسفاتی است که در محیط کشت MS  استاندارد(25/1 میلی مول) وجود دارد. در کشت سوسپانسیون سلولی Ginkgo biloba  تمام فسفات موجود در محیط کشتMS طی 11 روز مصرف گردید.

3-1-3-6 سولفور

سولفور در اسیدهای آمینه، میتونین، سیستین، گلوتاتیون تری پپتید و ویتامین تیامین و بیوتین یافت می شود. سولفور معمولاً در فرمهای سولفات در محیط کشت های فراهم می شود در محیط کشتی که سولفور حاوی اسیدهای آمیه ال سیستین، ال سیستئین،ال متیونین یا گلوتانیون جایگزین سولفات شده بود بعضی از کشتها( مانند توتون) بخوبی رشد کردند.

 3-1-3-7 سدیم

گرچه سدیم در تعدادی از محیط های کشت بر حد عناصر پر مصرف وجود دارد ولی در بیشتر گونه ها یک عنصر ضروری بشمار نمی آید. بیشتر گونه های چوبی، سدیم، را در غلظت بالا تحمل نمی کند. کشت Pinus radiate تا 5 میلی مول سدیم را بدون  مشاهده اثرات سمی تحمل کرده است. برخی آتیونهایی که به محل کشت اضافه می شوند. به صورت نمک های سدیم است که این به دلیل قابلیت حل آنهاست.

 آگار دارای مقدار زیادی سدیم است. بعلاوه درصورتی که PH محیط کشت با تنظیم شود مقدار قابل توجهی سدیم به محیط کشت اضافه خواهد شد.

 3-1-3-8 کلر

 کلر در فتوسنتز نقش دارد و تصور می شود بعنوان یک یون مخالف در هنگام تغییر پتاسیم، فشار تورژسانس سلولهای محافظ را کنتر کند. علایم کمبود شامل کاهش سرعت تکثیر سلولی و نکروزه شدن نسبی است.

 همانطور که قبلاً اشاره شد( بخش 3-1-3-2) اغلب از کلراید بعنوان یک آنیون برای کلسیم استفاده می شود. این عمل بخاطر این است که کلسیم قابل حل گردد. البته بایستی در این رابطه احتیاط نمود. زیرا کلر در غلظت کم در کشش های بعضی گونه های چوبی موجب مسمومیت می شود بنابراین محیط کشت مخصوص گیاهان چوبی(WPM ) یک محیط کشت عمومی برای گونه های چوبی نهاندانه است. در این نوع محیط کشت استفاده از سولفات بر نمک های کلر، در جایی که ممکن باشد ارجحیت دارد. البته کشتهای Pinus radiate برای رشد مناسب به کلر نیاز دارند.

3-4-1 عناصر کم مصرف

تعیی مقدار موردنیاز عناصر کم مصرف مختلف اغلب بسیا  مشکل است. زیرا برخی از عناصر این گروه از ظرف شیشه ای محیط کشت به داخل آن وارد می شوند این عناصر همچنین در آگار و نیز بصورت ناخالصی در تعدادی از مواد شیمیایی وجود دارند که به محیط غذایی اضافه می شوند بنابراین مقدار آنها بسته به این که ظروف مصرف شده جدید یا قدیمی باشند از آزمایشی به آزمایش دیگر تغییر می کند. که این حالت می تواند برای رشد ضروری نموده ولی می توانند برای تحریک فرآیند های خاصی مفید باشند.

 برخی از عنصر های غیرضروری مثل کبالت بطور مداوم د رمحیط غذایی کشت بافت وجود دارد. عمل اصلی عنصرهای کم مصرف را در محیط غذایی کشت بافت درختانبه تفصیل بیان کرده است اکثر اطلاعاتی که در ادامه می آید از مطالب او بدست آمده است.

 3-1-4-1 آهن

آهن در طیف وسیعی از فرآیند های اکسیداسیون دارای نقش کلیدی است که در آنزیم های نیترات ردوکتاز، کاتالاز، سیتوکرومهای تنفسی و سایر آنزیمها یافت می شود. ویژگی عموی کمبود آهن کلروزه شدن شاخ و برگ ها است. در صورتی که عناصری چون مس، نیکل، روی، و فسفر بیش از حد وجود داشته باشند می تواند باعث بروز کمبود آهن گردند. همچنین اگر آهن بیش از حد نیاز باشد می تواند به کمبود روی منجر گردد. آهن در محیط کشت سهم عمده ای در کاتالیزور نوری تخریب IAA دارد.

 به دلیل اینکه نمک های آهن کاملاً قابل حل نیستند آهن معمولاً بصورت  ( بخش 3-1-9 ) تهیه می گردد. در برخی محیط کشت های مانند MS   آهن همراه با فسفات بصورت رسوب درمیآید. رسوب آهن که در نهایت می تواند به کمبود آن منجر گردد توسط pH بالای محیط کشت ایجاد می شود. کاهش مقدار آهن به غلظت آن در محیط کشت MS در حالی که غلظت EDAT در حد نرمال خود باقی بماند می تواند مانع رسوب گردد. در صورتی که EDAT افزایش یابد در حالیکه مقدار آهن در حد نرمال حفظ شود منجر به سمیت EDAT می گردد. در کشتهای سوسپانسیون سلولی   radiate Pinus   مصرف 20 میلی مول   بر ای رشد سلول مناسب بوده است.در حالیکه مصرف EDAT بیش از مقدار آهن مانع رشد شد. کلروز ناشی از آهن یک مشکل عمومی در Pyrus است، بخصوص در خاک هایی که محتوی کربنات کلسیم هستند برای اینکه مشخص شود آیا کشت بافت می تواند در انتخاب پایه هایی که تحمل به کمبود آهن دارند استفاده گردد آزمایشی انجام شد در این آزمایش کشت گونه های متعددی در محیط کشتهایی که با  یا  و همراه یا بدون بی کربنات تهیه شده بودند مورد بررسی قرار گرفتند. جایگزین شدن  بجای  سبب کلروز شدن گیاهان شده و واردشدن بی کربنات این وضعیت را تشدید کرد و در این آزمایش مشخص گردید واکشنهای مشاهده شده به ژئوتیپ و نیز عکس العمل ژئوتیپها در مزرعه بستگی دارد. با توجه به نتایج این آزمایش نتیجه گیری شد که کشت این ویترو می تواند برای انتخاب گیاهانی با حساسیت کمتر نسبت به شرایط کمبود آهن مفید واقع گردد.

 3-1-4-2 منگنز

منگنز در اثرات متقابل پیچیده ای که در کشت بافت موجود است دخالت دارد. این عنصر بعنوان یک کوفاکتور در اکسیداسیونIAA و کاتالیزور در اکسیداسیون حفاظت کننده اکسین عمل می کند. ریز نمونه های Vitis vinifera زمانی که روی محیط کشت دارای 5 میلی مول منگنز کشت شدند تعداد ساقه و ریشه بیشتری نسبت به محیط کشتی که دارای 100 میلی مول بودند تولید کردند. این کشتها در شرایط نور آبی و روی محیط کشت های بدون یدور پتاسیم نگهداری شده بودند. گونه دیگری که نیاز کمی به منگنز دارد Manihot esculenta است. کشتهای جوانه جانبی اینگونه در محیط کشتی که غلظت منگنز در آن 25 تا 100 برابر کمتر از محیط کشت MS بود بخوبی رشد کردند. دلیل مناسب بودن غلظت منگنز در این کشتها این بود که مولیبدات موجود در محیط کشت هم دارای غظت کمی بود. در حالی که اگر غلظت مولیبدات بیش از این بود منگنز ایجاد سمیت می کرد. زیادی منگنز می تواند به کمبود آهن منجر گردد. برخی گونه ها برای رشد مناسب خود نیاز به غلظت بالای منگنز در محیط کشت دارند. در کشتهای Prunus تولید ساقه در محیط  کشتی که از نظر منگنز و مس در سطحی برابر محلول عناصر کم مصرف هلر بود کمتر از محیط کشتی بود که غلظت این دو 100 برابر بیشتر بود. این کار به فرموله شدن محلول ریز مغذی QLP منجر شد محیط کشت دیگری که از نظر منگنز و مس دارای غلظت بالایی است محیط کشت لیتوی است که برای سوزنی برگها استفاده می شود.

 منگنز جذب آهن را محدود می کند و اثرات سمی منگنز توسط کلسیم خنثی می گردد. منگنز می تواند در تعدادی از واکنشهای آنزیمی جانشین منیزیم گردد. در بسیاری از محیط های کشتی که برای سوزنی برگها استفاده می شود غلظت منگنز نسبت به منیزیم بالا است. جذب منگنز در محیط کشت سوزنی برگها در رقابتی که با مس ایجاد می گردد محدود می شود.

 3-1-4-3 بر

بر عنصری ضروری بوده که در متابولیسم کلسیم، ساخت دیواره سلولی، چوبی شدن، تمایز یافتن آوند، آبکش توسعة سلول متابولیسم اکسین و فنل دخالت دارد. همچنین بر صحیح عمل کردن غشای سلولی نقش دارد. احتمالاً این عنصر ریشه زایی را از طریق برانگیختن چوبیشدن تحریک می کند. با اینکه این عمل را از طریق پائین آوردن سطح اکسین داخلی گیاه که توسط فعال کردن آنزیم IAA اکسیداز صورت می گیرد انجام می دهد. بین بر و کلسیم اثر متقابلی وجود دارد که قبلاً بحث شده است.

در محیط کشت لیتوی بر در غلظت های بالا وجود دارد. همانطور که قبلاً بیان شد در این محیط کشت غلظت منیزیم بالا و غلظت کلسیم پایین است. بنابراین برای حمایت از رشد مناسب سلول ها ممکن است وجود بر در غلظت بالا ضرورت داشته باشد.  کمبود بر زمانی باید مورد توجه قرار بگیرد که در محیط کشت پروتوپلاست از سوربیتول یا مانیتول برای ایجاد شریط اسمزی با غلظت بالا استفاده شوند این دو نوع کربوهیدرات باعث تثبیت بر شده و آنرا از دسترس سلول خارج می کنند.

 3-1-4-4- روی

روی در برخی از آنزیم ها شامل RNA پلیمر از سوپراکسید دیستوتاز و برخی از دی هیدروژناز ها وجود دارد. جذب روی توسط مس و آهن ممانعت ولی توسط سولفات تحریک می گردد. کمبود روی در کشت یافت رایجتر  از کمبود مس است. در  حالی که مس مورد نیاز از طریق ناخالصی ها باندازه کافی برآورده می گردد. میزان روی که از طریق آلودگی های موجود در مواد شیمیایی با ظروف شیشه ای بدست می آید کافی نیست. کمبود روی زمانی که EDAT آزاد در دسترس بوده و بتواند با آن کمپلکس تشکیل دهد تشدید می گردد.

 3-1-4-5 مس:

مس همانند آهن در کنترل رداکس نقش داشته و بعنوان یک کوفاکتور در اکسیداسیون سیترکروم عمل می کند. در سلول های Acer pseudplatatnus که  ر محیط کشت دارای کمبود مس کشت شده بود سطح آنزیم های سیتوکروم اکسیداز و سوپراکسید دیسموتاز در میتوکندریها کاهش یافت. محیط کشت لیتوی و QLP دارای مس بالایی هستند. میزان مس در بافتهای جوانف به خصوص جینها در سطح بالاتری از اندام های بالغ قرار دارد. در حالی که عکس این مطلب در رابطه با منگنز صحیح است. به همین جهت پیشنهاد شده که ریز نمونة بافتهای جوان ممکن است برای رشد خود به مس بیشتر ومنگنز کمتری نست به بافت های بالغ نیاز داشته باشد. کمبود مس در کشتهای سوسپانسیون سلولیPinus taeda و P.radiata به سختی دیده میشود؛ زیرا کششها برای فتوسنتز و بیوسنتز لیگنین نیاز به مس ندارند. آگار حاوی  سطوح بالایی از مس است. بنابراین با بروز کمبود مس در بافتهای در حال رشد روی محیط کشت دارای آگار غیرمحتمل است. زیادبودن مس در محیط کشت می تواند آنزیم های فنولاز محتوی مس را فعال کند که این عمل باعث قهوه ای شدن بافتهای کشت شده ای می شود که به قهوه ای شدن حساس هستند. علت این که در بعضی از محیط کشتهای که مس در سطحی که معمولاً سمی است تحمل می شود ممکن است زیادی EDAT در آن محیط می باشد.

3-1-4-6 ید

چی و چی و پول اثرات ید در کششهایVitis vinifera  را مطالعه کردند اکثر اطلاعاتی که آورده می شود مربوط به مقالات آنها ست. ید بعنوان یک عنصر ضروری بای رشد محسوب نمی شود، با این وجود در بیشتر محیط های غذایی کشت یافت وجود دارد. در کشش های ساقه Vitis اثرات متقابل پیچیده ای بین ید، منگنز، و کیفیت نور دیده شده است. همانطور که قبلاً اشاره شد( بخش 2-1-4-2)  کاهش منگنز در بین ید، منگنز و کیفیت نور دیده شده است همانطور که قبلاً اشاره شد کاهش منگنز در محیط کشت، تولید ساقه را افزایش می دهد. البته چنین حالتی تنها زمانی دیده شد که کششهای Vitis در شرایط نوری آبی به جای نور قرمز نگهداری شدند و ید در محیط کشت بخوبی کاهش می یافت. ید از طریق رنگدانه های متعدد جاذب نور شامل فلاوین ها، انتقال انرژی آزادشده را محدود کرده و اکسیداسیون نوری و انتقال IAA را تحت تأثیر قرار می دهد. با حذف ید از محیط کشت ممکن است امکان انتقال IAA از بافت به محیط کشت دارای آگار تسهیل شود و در نتیجه غالبیت انتهایی کاهش یابد.

 برای کشت Pinus taeda در محیط لیتوی به مقدار بالایی از ید موردنیاز بود. این نیاز بالا ممکن است به دلیل سطح پائین کلر در محیط کشت باشد.

 3-1-4-7  مولیبدن

مولیبدن در آنزیم های متعددی نظیر نیترات ریداکتاز وجود دارد. زمانی که گیاه،  در شرایط کمبود مولیبدن و به دنبال آن کمبود نیترات ریداکتاز در یک سوبستریت حاوی نیترات رشدداده شد سطوح سمیت نیترات در آن مشاهده گردید. اگر نیترات در سوبستریت توسط نیتروژن غیر نیتراتی جایگزین شود علایم کمبود مولیبدن کمتر بروز می کند. مولیبدن معمولاً در بافتها و در اکثر محیطهای غذایی کشت بافت فقط به مقدار کمی وجود دارد. اثرات متقابل بین مولیبدن و منگنز قبلاً مورد بحث قرارگرفته است.( بخش 3-1-4-2)

3-1-4-8 کبالت

کبالت تقریباً در بیشتر محیط های کشت غذایی وجود دارد، اگرچه هنوز بخوبی روشن نیست که آیا کبالت در تغذیه گیاهان عالی نقش اساسی دارد یا خیر؟ حتی اگر کبالت عنصر ضروری نباشد، با این حال نقشهای مفید و متعددی در کشت یافت می شود. کبالت فعالیت اکسین و سیتوکینین را محدود می کند. همچنین کلسیم و مسی که تولید اتیلن را موجب شد کاهش می دهد. بنابراین ممکن است از آن در زمانی که وجود اتیلن مطلوب نیست استفاده کرد. در کشت یافت هویج، کبالت ازطریق ممانعت از سنتز اتیلن جنین زایی راتحریک کرد البته در سایر کشتها ممانعت از سنتز اتیلن تویط کبالت یا نیکل سبب می شود که تشکیل چنین غیر جنسی نیز محدود گردد. کشت بافت تعدادی از گونه های گیاهی شدیداً به کبالت حساس است.   در بعضی از آنها غلظت کمتر از  مول نیز اثر بازدارندگی داشته است.

 3-1-4-9 نیکل

نیکل در متابولسیم نیتروژن دخالت دارد، نیاز به این عنصر در محیط کشت بافت زیاد نیست. معمولاً میزان مورد نیاز از طریق نیکلی که در آلوده کننده های مواد شیمیایی در محیط کشت غذایی هست تأمین می گردد. نیکل مانند کبالت می تواند مانع تولید اتیلن گردد. در برخی موارد این عمل باعث تحریک جنین زایی می شود.

 3-5-1 تکمیل کننده های آلی

3-1-5-1 ویتامینها

بافتهای گیاهی خود اکثر ویتامینهای مورد نیاز متابولیسم را تولید می کنند. با این حال در شرایط این ویترو تولیدات گیاهی(  داخلی) بعضی ویتامینها بویژه تیامین برای رشد مطلوب کافی نیست، بنابراین تعدادی از ویتامینها نظیر نیاسین( اسیدنیکوتینیک) پیریدوکسین و تیامین بطور متناوب به محیط کشت اضافه می شوند و گاهی پانتوتنات کلسیم و ریبوفلاوین نیز افزوده می شود. نیاسین در حفظ NAD و NADP انتقال الکترون و هیدروژن، آنزیم های دی هیدروژناز، کاتابولیسم چربی و فتوسنتز دخالت دارند.این ویتامین در برابر نور و حرارت از بین نمی رود. پیریدوکسین متابولیسم پروتئین، هیدرات کربن و چربی را تنظیم می کند. این ویتامین در برابر حرارت ثابت بوده ولی در محلولهای قلیایی در برابر نور از بین می رود.

 تیامین یک کوآنزیم در متابولیسم پیروات است. تیامین در برابر حرارت ثابت نیست و  در زیر نور u .v  تجزیه می گردد. همه این ویتامینها بصورت مشارکتی(سینرژیک) با یکدیگر فعالیت می کنند. میو – اینوزینول یکی از اجزای  فعال شیر نارگیل است. در سالت فسفولیپیدها و پکیتنهای دیواره سلولی و احتمالاً تنظمی اسمزی سلول گیاهی دخالت دارد. در محیط کشت همیشه نیاز به میو- اینوزیتول نیست. بعضی از زیزنمونه ها که حالت شیشه ای شدن در آنها انجام نمی گیرد، اینوزیتول را بیش از  کفایت تولید می کنند و بنابراین نیاز به این ماده شیمیایی ندارند. علی رغم این که نیاسین، پیریدوکسین ، تیامین و میو – اینوزیتول عالباً اتوکلاو می  شوند ولی در برخی تحقیقات ضدعفونی ها آنها با صافی را توصیه می کنند. پانتوتنیک اسید نیز در اثر اتوکلاوکردن از بین می رود. اسیدنیکوتینک، پیریدوکسین، و تیامین به سرعت توسط سلولهای در حال رشد مصرف شده و از محیط کشت حذف می گردند.

 اکثر محیطهای کشت دارایویتامینهای میحط کشت پایه MS هستند البته مطالعات کمی درباره این که آیا ترکیب ویتامینی MS براستی در محیط کشت درختان نیز می تواند مناسب باشد انجام گرفته است ویتامین را در کشتهای بافت توموری Pice glauca آزمایش کردند. از میان آنها فقط تیامین، اینوزیتول، نیاسین، اسید آسکوربیک برای رشد نیاز بودند. در آزمایشی که در آن جنین های جدا شده استفاده گردیده بود چندین ویتامین د رغلظت های  و  برابر غلظت های تیمار شاهد( 16 میکرومولکول نیاسین، 5 میکرومولکول پیریدوکسین، 15 میکرومولکول تیامین، 555 میکرومولکول میواینوزیتول) بررسی شد. نتایج این آزمایش نشان داد که تیمار غلظت  غلظت شاهد برای تشکیل ساقه نابجا مناسب است. میواینوزیتول سبب افزاش رشد کالوس Ulmus comperstris و نیز Fraxinus pennsylvanica گردید. سلول های Acer pseudoptatanus در حالت سوسپانسیون در یک روند بسیار سریع میوانیوزیتول را مصرف کرده و از محیط کشت حذف کردند. افزایش غلظت RAP در میحط کشت به شدت جذب مواد میواینوزیتول راکاهش می دهد. تولید کلنی های سلول از پروتوپلاستهای با غلظتهای بالای میواینوزیتول در محیط کشت( به ترتیب 6و 5/7%)تحریک شده ریبوفلاوین باعث تحرییک ریشه زایی در کشتهای Eucalyptus ficifolia گردید البته چنین تحریکی در شرایط روشنایی انجام گرفت زیرا زیبوفلاوین در شرایط تاریکی بی اثر است. از طرف دیگر ریشه زایی در ساقه های pyrus betulaefolia توسط ریبوفلاوین محدود شده در کشت Populus trenula   و در طی تشکیل ساقه غلظت بالای تیامین همراه با لیسین جانشین موثری برای سیتوکینین  و مقداری از ویتامینها بود . تحریک تیامین و لیسین بعنوان محرک بیوسنتز برخی ویتامینها مشخص شد.

 3-1-5-3 اسیدهای آمینه

اوایل برای کشت بافت از تولیدات طبیعی نظیر شیر نارگیل، کازئین، هیدرولیز شده و عصاره مخمر جهت تهیه نیتروژن آلی محیط کشت استفاده می کردندن. سالهاست که ین تولیدات ابتدا توسط تولیدات پیچیده اسیدهای آمینه و آنگاه که نیاز بافتها بهتر تشخیص داده شد با مخلوطی از اسیدهای آمینه ساده تر جایگززین شده است. رایزر و وایت نشان دادندد که محیط کشتی که دارای ال – گلوتامین باشد از نظر حمایت رشد کالوسهای حاصله ازتومور های Picea glacua  نسبت به محیط کشتی با ترکیبی از 18 اسیدآمینه مؤثر تر است. از میان اسیدهای آمینه آزمایش شده فقط گلیسین برای ایجاد ساقه نابجا در جنین های کشت شده Pinus contorta نیاز بودند در کشت بافت Pinus radiate  آرژنین، گلوتامین، یا آسپاراژین می توانند جایگزین نمک های آمونیومی گردند. برای عمل نجات جنین از میان اسیدهای آمینه متعدد بررسی شده اسیدهای آمینه ال – سرین- و ال گلوتامین در یک رقم از Vitis vinifera و ال- سیستئین و الآسپاراژین در سایر ارقام بیشترین تأثیر را داشته اند.

  امروزه ال – گلوتامین متداولترین اسیدهای آمینه است گرچه آسپاراژین، آرژنین، و  گلیسین هنوز هم مورد استفاده اند. آل گلوتامین در حرارت بالا ا ثر خود را از دست میدهد. بنابراین برای ضدعفونی آن باید از صافی استفاده کرد. متأسفانه این ماده از نظر شیمیایی ناپایدار است، بخصوص اگر در حضور فسفات باشد. کشت سلول های Pseudotsuga menziesii در محیط کشت حاوی گلوتامین نسبت به محی شت فاقد آن باعث مقاومت بیشتر سلول ها در برابر تنش آب گردیده است. گلوتامین یک منبع نیتروژن احیاء شده است که از نظر نرژی لازم برای جذب، نسبت به نیترات یا آمونیوم به انرژی کمتری نیاز دارد. در کشت بافت Prosopis alba تکثیر ساقه با آسپاراژین بیشتر از گلوتامین و اسید آسپاراتیک تحریک شد. طویل شدن ساقه با اسیدهای آمینه گلوتامینو آسپاراژین بیشتر از اسیدهای گلوتامیک و آسپاراتیک بود در  این کشتها اورئید آلانتورئین بعنوان یک منبع نیتروژنی باندازه آسپاراژین یا گلوتامین مؤثر بوده است. تجمع اسیدهای آمینه د ر سلول ها در شرایط این ویترو با PH میحط کشت به شدت بستگی دارد.( بخش 3-1-10) جزئیات بیشتر در رابطه با نحوة عمل اسیدهای مختلف در کشت بافت درختان را می توان در بررسی های جدیدی که توسط کربی و همکاران و دورزان انجم شده است ملاحظه کرد.

 پلی آمینهایی که از اسیدهای آمینه بدست می آید نیز می توانند در کشت بافت بکار روند. این مواد در تقسیمات سلولی، تشکیل ریشه و شروع گلدهی دخالت دارند.در کشتهای کالوس مگاگامتوفیتها Picsea abies  پلی آمینهایی نظیر پوترسین،اسیرمیدین، و اسپرمین برای رشد مناسب بودند. مقدار اسپرمین در ریر نمونه هایی کوتیلدونی Pinus radiate  زمانی که در شرایط تشکیل ساقه قرار گرفتند افزایش یافت. همراه یا بدون ترکیبی از پرترسین، اسپرمینف و اسپرمیدین جنین زایی غیرجنسی رادر کشتهای کالوسی Hevea brasiliensis تحریک کردند. کالوسهای جنین زا  را در همینگونه محتوی اسیدآمینه بیشتری به کالوسهای غیرجنسی بودند. پوترسین تشکیل ساقه نابجا در قطعات برگ Betula pendula را تحریک کردند.

 3-1-5-3 شیر نارگیل و سایر محصولات طبیعی

در اوایل برای انجام کشت بافت شیر نارگیل و سایر فرآورده های اندوسپرمی در محیط  کشت غالباً ضروری بودند همچنین محصوالت طبیعی  نظیر کازئین هیدرولیز شه و عصاره مخمور نیز متداول بود فرآورده های آندوسپرمی به خصوص شیر نارگیل دارای فعالیت های سیتوکینینی می باشند. این مورد بویژه قبل از شناخت هورمون سیتوکینین بسیار با اهمیت بوده بعلاوه محصولات طبیعی فوق منع نیتروژنی احیا شده و طیفی از ترکیبات پیچیده شیمیایی را که دارای توانایی تحریک رشد  اندام زایی بودند فراهم می کردند متأسفانه ترکیب شیمیایی این محصولات چندان دقیق شناخته نشده و ترکیب آنها اغلب از یک نمونه به نمونه دیگر متغیر است. مورد ودم که بخصوص در رابطه با شیر نارگیل صادق می باشد این است که براساس منشأ تهیه شیر،مدت زمانی که از برداشت آن گذشته و طول مدت نگهداری خصوصیات آن تدریجاً تغییر می کند. بنابراین در طول چندین دهه گذشت جایگزین های شیمیایی بطور گسترده ای جانشین این محصولات طبیعی شده اند.

 کاربرد شیر نارگیل هنوز در برخی از محیطهای ضروری است بعنوان مثال از آن هنوز در کشت بافت Bamnusa arundinacea و Denderocalamus brandisii استفاده می شود. در کشت پروتوپلاست Visit vinifera افزودن عصاره نارگیل باعث بهبود در توانایی زنده ماندن پروتوپلاستها گردید. ترکیب شیمیای شیر نارگیل بطور گسترده ای تجزیه شده است. براساس یکی از تجزیه هایی که اخیراً انجام گرفته الیگو ساکارید های متفاوتی که بعضی از آنها فعالیت های مشخص تنظیم کننده های رشد را دارا هستند در شیر نارگیل وجود دارد.

کازئین هیدرولیزشده در کششهای هاپلوئید و دیپلوئید جنینی larix deciduas و Leptolepis ودر کشش های جنینی Aesculus hippocatanum به کار رفته است. البته در کشت جنین های نابالغ تخمی Picea moriana این ماده جنین زایی سوماتیکی شده است. کارتین هیدرولیزشده، عصاره مالت و آدنین سولفات در محیط کشت ریز ازدیادی Carica papaya وجود داشتند.

 در کشت سوسپانسیون سلولی تراکم سلولی نسبت به محیط کشت جامد اغلب بیشتر است و این تراکم افزونتر از محیط کشت جامد غالباً مانع رشد می گردد. در اکثر موارد این محدودیت به دلیل نیاز به یک محصول طبیعی در محیط کشت است که از سلول ها تراوش می شود. زمانی که تراکم سلولی خیلی کم باشد غلظت ماده تراوش شده در محیط کشت کمتر از مقدار موردنیاز برای رشد سلولهاست. در کشت بافت تعدادی از در ختان نیاز محیط کشت به چنین تراوشاتی( محیط کشت مشروط) مشاهده شده است. استوارت و استریت( 1971) دریافتند که به یک عامل فرار با ترکیب ناشناخته که از سلولهای فعال در حال رشد آزاد می گردد برای تداوم رشد سوسپانسیون سلولیAcer pseudoplatanus نیاز است. تیدال و ریچارد دز یک عامل محرک با وزن مولکولی کمتر از1000 دالتون را از محیط کشت عاری از سلول که قبلاً برای سوسپانسیون سلولی Pinus radiate استفاده شده بود جدا کردند. محیط کشتی که برای رشد پروتوپلاستهای Sequoia sempervirents استفاده شد با یک محیط کشت صاف شده ای که برای کشت سوسپانسیون سلولی sequoiadendron giganteum بکار رفته تکمیل شده بود.

 3-1-6 تنظیم کننده های رشد

تنظیم کننده های رشد گیاهی به پنج دسته اصلی به نام های اکسینها، جیبرلین ها سیتوکینین ها، ایدابسیسیک و اتیلین طبقه بندی شده اند. این موارد در هیچ یک از فرآیند های رشدی یا فیزیولوژیکی شرکت نمی کنند. بلکه برعکس هریک ازفرآیند های رشدی توسط اثرات متقابل دو یا بیشتر از این تنظیم کننده ها کنترل می گردند. در کنار اینها، مواد شیمیایی دیگری در داخل سلول های گیاهی وجود دارند که رشدونمو را کنترل می کنند. بعلاوه طیف وسیعی از مواد شیمیایی مصنوعی وجود دارد که اغلب بنحو خاصی نمو گیاه را تغییر می دهند. تعداد زیاد ترکیبات تنظیم کنندهه رشد و روش پیچیده ای که اینها و بافتها روی یکدیگر عمل می کند محققان را وادار به ارائه پیشنهاد کرد که اگر بافتها درموقعیت مناسب پذیرش نباشند پاسخ مناسبتر و به تنظیم کننده های رشد خارجی نخواهد داد. در این حالت دیگر مهم نیست که این تنظیم کننده ها در چه غلظت و یا ترکیبی استفاده شوند. عدم توانایی عکس العمل نسبت به تنظیم کننده های رشد اغلب زمانی بعنوان یک مشکل بروز می  کند که ریز نمونه های کشت شده از درختان بالغ به دست آمده باشند ولی زمانی که ریزنمونه هایدرختان جوان استفاده می شود این مشکل کمتر بروز می کند همانطور که در بخش 5-3-3-1 اشاره شد هنگامی که عدم عکس العمل به عنوان یک مشکل بروز می کند در اولین گام باید مشخص نمود کدام ریزنمونه بیشترین عکس العمل را نشان می دهد.  پس از آنکه ریزنمونه های پذیرنده تعیین شدند می توان از یک روش معمول کشت استفاده کرد. در این زمان است که باید به تعیین محیط شت غذایی و عامل های محیطی بهینه اقدام نمود.

 برای کنترل رشد و تمایز ، تنظیم کننده های رشد یا به محیط کشت غذایی اضافه می شوند یا قبل از  کشت در یک زمان کوتاه بکار می روند. هنگامی که تنظیم کننده های رشد توسط سلولها جذب شدند در تقابل با تنظیم کننده های رشد ساخته شده در داخل سلول قرار خواهند گرفت. اگر سلول آماده باشد عکس العمل های رشد بدنیال خواهد آمد. برای دستیابی به واکنش مطلوب همیشه نیازی به تنظیم کننده های رشد خارجی نیست در برخی مواقع واکنش مناسب می تواند از طریق فراهم آمدن عوامل فیزیکی یا شیمیایی داخلی تحت تأثیرمدت، کیفیت و شدت  نور و نیز عواملی محیطی شیمیایی نظیر عناصر غذایی کم مصرف یا پرمصرف هستند. بعلاوه فعال کردن یا نکردن مسیرهای متابولیسمی بیوسنتز اسیدهای آمینه معطر و تنفس، سطح هورمونهای  داخلی را تغییر خواهد داد. بنابراین روشهایی که در این مسیرهای متابولیسمی مؤثر است بر رشد کشش ها نیز اثر گذار خواهد بود و درنتیجه تنظیم رشد و ریخت زایی توسط عواملی غیر از افزودن تنظیم کننده های رشد به میح کشت شایسته توجه است.

 3-1-6-1 اکسینها

 اکسینها در تقسیم سلولی و بزرگ شدن آن و در ساخت دیوارة سلولی دخالت دارند. اکسین طبیعی اصلی IAA  است غالباً IAA به دلیل ناپایداربودن در کشت بافت درختان بکار نمی رود. در زمان تهیه محیط کشت در حدود موجود در محیط کشت MS با 20 دقیقه اتوکلاو از بین می رود. وجود آهن در محیط کشت تجزیة IAA در مجاورت نور را تحریک می کند. مقدار تجزیة IAA در کشت نوک ساقه Musa acuminate در شرایط نور بسیار سریعتر از حرارت بالا بوده است در محیط کشت توسط نور می توان نور را از صافی عبور داد که طول موجهای کمتر از 450 نانومتر را حذف کند. ریبوفلاوین اکسیداسیون نوری IAA و سایر اکسیها را تحریک می کند. عکس العمل Eucalyptus ficifolia که در محیط کشت حاوی IAA و و ریبوفلایوون در شرایط نوری کشت شد به نحوی بود که تصور می شد در محیط  کشت اکسین وجود ندارد.

3-6-1-2 سیتوکینینها

یکی از اعمال سیتوکینینها در کشت بافت ایجاد ساقه نابجا است. همچنین سیتوکینینها برای تشکیل کالوس و سایر فرآیند های درگیر در تقسیم سلولی نیز مورد نیازند. این مواد برای حذف غالبیت انتهایی از جوانه جانبی نیز بکار میورند. بنابراین آغازگر تکثیر ساقه هستند. سیتوکینینها بعضی مواقع از اثرات نور تقلید کرده و جذب پتاسیم را تحریک می کند. بعلاوه علیرغم اینکه ABA روزنه ها را می بندد، سیتوکینینها اغلب اثرات عکس دارند. این اثر سیتوکینیها در زمانیکه میکروپروپاگولا تجمع می یابند باید مورد توجه قرار گیرند. در کشت جنینهای Pinus ponserodsa BA تشکیل پپتیهای مربوط به آنزیم ریبولوز -5.1 – بی فسفات کربوکسیلار (RUBP )  را تحریک می کند. یکی از این پپتیدها در کوتیلدونهایی که ساقه های نابجا را تشکیل می دهد ظاهر می شود در برخی از موارد سیتوکنینها برای ایجاد جنین زایی سوماتیکی مورد نیاز هستند در کشت بافت Vitis vinifera جنین زایی فقط در زمانی که 2,4-D همراه با BA بکار رفته ایجاد شده است.

 نور می تواند بر عمل سیتوکنین اثر بگذارد تشکیل ساقه در کشت ساقه Prunus institia توسط BA در معرص نور انجام گرفت. اما BA از طویل شدن ساقه در کشتهایی که در شرایط تاریکی با روشنایی نکهداری شده بودند جلوگیری نمود.

 انواع متداول سیتوکنینها عبارتند از BA ، کینتین، 2-Ip و زئاتئین. دو نوع آخر از سیتوکنین های طبیعی می با شند از میان اینها BA فعالترین، ارزانترین و تنها نوعی است که می تواند اتوکلاو گردد. بنابراین BA بیشترین کاربرد را داراست، بخصوص در کارهای ریز ازدیادی تجاری که هزینه و سادگی کار مورد توجه است. ساقه های نابجای ایجادشده توسط BA در ریز نمونه های جنینی Pinus strobus  10-20 برابر مؤثرتر از 2-ip بوده است. به همین صورت ریز نمونه های برگی Garcinia mangostana در محیط کشت حاوی زئاتین تشکیل شده بود بیشتر از محیط کشت دارای BA  یا 2-ip یا تیدیازورون بود.

 3-1-6-3 جیبرلینها

جیبرلینها طویل شدن سلول شکستن خواب جوانه و بذر را کنترل می کنند ودر عملگلدهی دخالت دارند. با این حال در رابطه با مفیدبودن اثرات GA در کشت بافت گونه های درختی گزارش کمی وجود دارد. بیشتر گزارش ها بیان می کند که GA بی اثر یا ممانعت کننده است. غلظت های پائین  مانع نمو جوانه ها در ریزنمونه های Araucaria بوده و هیچ اثری روی کشت کوتیلدونهای Pinus radiate و کشت مریستم های giganteum Sequouiadendron   نداشته است.  در کشت باقت تعدادی از گونه های نهان دانگان بکار رفته است. استفاده از یک میلی گرم در لیتر آن مانع از رشد طولی ریشه در Robinia pseudoacacia شده است در مرکبات در شرایط این ویترو  تولید انشعابات نا بجای کیسه های آب دار را تحریک  کرده و بلوغ آنها را به تأخیر میاندازد.

 گاهی اوقات  در ریشه زائی مؤثر است.در قلمه های Pinus radiate در صورتی که  در چهار روز اول پس از قلمه گیری استفاده شود[( مرحله قبل از شروع ریشه زایی) مانع ریشه زایی ناشی از IBA می گردد و ریشه زایی می شود کاربرد آن پس از شش روز مانع رسشد مجدد سلول های مریستمی گردیده است. همچنین در کشت برخی ژئوتیپهای Morus ؛ تشکیل ساقه و یا ریشه را تحریک کرده است.

 بیوسنتز جیبرلین توسط طیفی از علفکش ها چون کلریدکلرمکوات[5] AMO-1618 و ترکیب تریازیدی پاکلوبوترازول خنثی میگردد. نحوه عمل مورد دوم اختصاصی تر از بقیه است. این ترکیبات ممکن است در جایی که مشکل رشدطولی گسترده یا جوانه  زنی پیش رس وجود داشته باشد مورد توجه قرار گیرند. جیبرلینها در مقابل حرارت پایدار نیستند.بنابراین نباید اتوکلاو شوند.

 3-1-6-4 اسیدآبسیسیک

دربین بازدارنده های طبیعی برجسته ترین آنها اسید آبسیسیک یا ABA ا ست. زمانی که درختان در معرض تنش قرار می گیرند واکنش آنها به تنش تولید ABA است ABA ،محرک انسداد روزنه است، بنابراین مکانیسم حفاظتی در هنگام بروز تنش آب ایجاد می کند. همچنین تجمع پرولین را تحریک کرده و حفظ پایداری غشا را در زمانی که سلول ها در معرض تنش قرار دارد انجام می دهد. سطحABA داخلی را می توان با کاربرد فلوریدن [6] که  مانع سنتز بیولوژیکی کارتنوئید و ABA است کاهش داد زمانی که بصورت محلول در برابر نور قرار می گیرد از نظر شیمیایی پایدار نخواهد بود.

 ABA   را نباید صرفاً بعنوان مانع تقسیم سلولی مورد توجه قرار داد، زیرا در برخی موارد دارای نقش ریخت زایی نیزهست. ABA و تعدادی از مواد مشابه آن ایجاد  جنین سوماتیکی را تحریک می کند اما مانع از رشد اولیه آن می شود. و در مراحل بعدی جنین زایی مانع جوانه زنی پیش رس که به طریقه ژنی کنترل شده می گردد. ABA  تجمع پروتئین ذخیره ای m-RNA  و پروتئینهای حاوی چربی را در طی جنین زایی سوماتیکی و زایکوتیک در گونه های دارای بذور روغنی تسریع می کند تجمع این مواد برای بلوغ جنین ضروری است. همچنین مرحله رویشی به گلدی دارای نقش اساسی است. در ریز نمونه های کوتیلدونی ABA, Pinus toeda تشکیل ساقه نابجا را افرایش داده است. برخی ترکیبات مشابه ABA در شرایط این ویتره به اندازه ABA مؤثر  هستند.

 ABA برای رشد طبیعی جنینهای سوماتیکی سوزنی برگها مختلف موردنیاز است. امابرای تعداددیگری این نیاز مشاهده نشده است. به همین صورت ABA برای رشد طبیعی جنین سوماتیکی در کشت برخی گونه های نهان دانه ضروری است. در کشت این ویترو Robinia pseudoacaica مانع تکثیر ساقه جنینی شده اما از رشد طولی ساقه جلوگیری نکرد.

 3-1-6-5 اتیلن و سایر تنظیم کننده های گازی

اتیلن یک تنظیم کننده رشد گیاهی است که در تعدادی از بافتها تولید می شود و نقش آن ر رسیدن میوه و پیری بافتها شایان توجه است. مهمترین جنبه اتیلن در فیزیولوژی درختان چنان تأثیر آن بر فنیل آلانین آمونیالیاز(PAL )  است. این آنزیم یک پراکسیداز اسیدی است که تنظیم کننده تشکیل لیگنین است. اتیلن دارای اثر عمیقی بر تنظیم رشد و ریخت زایی شامل ریشه زایی است از این اثرات نباید در کشت بافت گیاهی چشم پوشی کرد، بخصوص چون اتیلن به سرعت می تواند در ظروف کشتی که فاقد منفذ کافی است تجمع یابد. انتشار اتیلن خصوصاً در کشتهای شیشه ای شده بالاست.

 جلوگیری یا تحریک تولید اتیلن در بافت توسط مواد شیمیایی متفاوتی که کاربرد آن در محیط کشت رایج است انجام می گیرد. همچنین پارامترهای محیطی نیز در تحریک یا جلوگیری از تولید آن مؤثر هستند. هرگاه تولید اتیلن یک مشکل محسوب می شود غالباً با تغییر این عوامل می توان تولید بیولوژیکی آن را کاهش داد. بعلاوه می توان برخی موادی را که بطور معمول از آنها در کشت بافت استفاده نمی شود جهت کنترل گسترش اتیلن به محیط کشت افزود.

 2-1-6-6 سایر محرکهای طبیعی و مصنوعی( سنتتیک)

فنل ها در تنظیم رشد گیاهی بصورت محرک یا بازدارنده نقش مهمی را ایفا می کنند.فنیلها تحریک رشد را غالباً از طریق تأثیر بربیوسنتزIAA افزایش می دهند. به عنوان مثال فعالیت شبه اکسینی اسیدفرولیک، کافئیک و کلروژنیک متناسب با بازداشتن آنزیم AII اکسیداز است یعنی حفاظت IAA از تجزیه شدن داخلی است. اسید فرولیک و کلروژنیک در قلمه های Pinus radiata فقط در صورتی که دوره کوتاه و خاصی استفاده شوند ریشه زایی را تحریک می کنند.

 فنل ها برای تغییر غلظت اکسین داخلی و بنابراین تغییر میزان تشکیل ساقه در کشتها استفاده شده اند. تولید ساقه در کشت های کوتیلدونی Pinus strobus توسط پی- هیدروکسی بنزوئیک اسید، 2-4- دی هیدروکسی بنزوئیک اسید و 3-4- دی هیدروکسی بنزوئیک اسید تحریک شده است. اسید شیکیمیک در کشت های Pinus sylvestris باعث تشکیل جوانه نابجا شد. و بطور معمول ریشه زای ساقه های تکثیر شده Sequoiadendron giganteum را تحریک می کند.

 فلوریدزین [7] که یک بازدارنده فسفوریلاسیون و احتمالاً IAA اکسیداز است بطور طبیعی در Malus وجود دارد. فلوروگلوسینول و اسیدفلورتیک از شکسته شدن فلوریدزین بدست می آیند هر دو ماده فلوروگلوسینول و اسیدفلورتیک در حضور اکسین محرک ریشه زای در قلمه ای حاصله از ریز ازدیادی Malus شدند در حالی که فلوریدزین در همین شرایط غیرفعال بود. فلوروگلوسینول عموماً برای ریز ازدیادی Maluse بکار می رود. گرچه در تمام ارقام فعال نبود و نتها گاهی اوقات در زیر نمونه هایی که از در ختان پیر نر تهیه شده فعال است. به همین صورت در کشتهای Prunuts فلوروگلوسینول زمانی مؤثر بوده که صرفاً ریزنمونه های حاصله از ساقه های غیرجوان بکار رفته باشد. فلوریدزین و فلوروگلوسینول درتحریک ساقه زایی و رشدکشت های Cinchona ledgeriana مؤثرتر از سایر ترکیبات فنلی بوده اند در این آزمایش همچنین مشخص شد که فلوروگلوسینول قابل اتوکلاو شدن است در حالی که فلورریدزین در حرارت بالا پایدار نیست. فلوریدزین و فلوروگلوسینول در برخی مواقع محرک جنین زایی سوماتیکی می باشند.

 3-1-6-7 دیگر بازدارنده های طبیعی و مصنوعی

بازدارنده ها را نبایستی مشخصاً ترکیباتی تصور نمود که سرعت رشد را کاهش می دهند. در کشت بافت بازدارنده های مختلف دارای اثر مشخصی بر ریخت زایی هستند. در این رابطه گفته شده است که گاهی کاربرد تنظیم کننده های خارجی در ایجاد ریخت زایی به دلیل سطح غلظت بالای آنها در گیاه بی اثر است. در چنین مواردی کاربرد بازدارنده ها در تغییر وظیفه سلول از تقسیم سلولی به تمایز، مؤثرتر از میزان بالای تقسیم سلولی بر تمایز، بازداشتن جنین زایی در کشتهای Elaeis guineensis توسط رشد سریع بافتهای ناشی از اکسین می باشد.

 3-1-6-7 دیگر بازدارندهای طبیعی و مصنوعی

بازدارنده ها را نبایستی مشخصاٌ ترکیباتی تصور نمود که سرعت را کاهش می دهند. در کشت بافت بازدارنده های مختلف دارای اثر مشخضی بر ریخت زایی هستند. در این رابطه گفته شده است که گاهیکاربرد تنظیم کننده های خارجی در ایجادد ریخت زایی به دلیل سطح غلظت بالای آنها در گیاه بی اثر است.در چنین مواردی کاربرد بازدارنده ها در تغییر وظیفه سلول از تقسیم سلولی به تمایز،مؤثرتر از کاربرد تنظیم کننده های رشد می باشد. نموه هایی از اثرات منفی ناشی از میزان بالای تقسیم سلولی بر تمایز، بازداشتن جنین زایی در کشتهای Elaeis guineensis  توسط رشد بافتهای ناشی از اکسین می باشد.

 تریگونلین بازدارنده ای است مشابه اسید آبسیسیک و در زمانی که گیاه در خواب یا در برابر تنش قرار می گیرد در سلول های گیاه تجمع می یابد. این بازدارندة طبیعی از نظر شیمیایی به گلایسین بتائین [8] مربوط می شود که در جوانه های در خواب زمستانه در ختان deltoids  Populus trichocarpa  در شرایط مزرعه و همچنین در میکرپروپاگولهای در شرایط غیرتنش نیز یافت شده که احتمالاً ناشی از حفاظت بیولوژیکی نیاسین است که از محیط کشت جذب شده است. تریگونلین ترجیحاً چرخه تقسیم سلولی را در مرحله G2 متوقف می کند و مشخص شده که درمرحله جوانه زنی بذر وظیفه کنترل کنندگی رشد را به عهده دارد.

 علفکشهای تریازول کاربرد گسترده ای در ریزازدیادی در ختان ندارند  ولی با وجود این، دارای خصوصیاتی هستند که ممکن است در ریزازدیادی مورد توجه قراربگیرند. به عنوان مثال تریادیمفون نشت الکترولیت پس از خسارت وارده توسط شوک حرارتی و سرما را خنثی می کند. این ماده همچنین تشکیل اپیدرم واکسی روی برگها و نیز جلوگیری از کاهش اتلاف آب را تحریک می کند که این می تواند بر سازگاری اندامهای در حال تکثیر کمک کند. علاوه بر این ریشه زایی را تحریک کرده،مانع بیوسنتز اتیلن شده، محرک تشکیل پلی آمین بوده، مانع پیری گشته و ممکن است در یک دوره کوتاهی ABA داخلی را به حداکثر برساند.

 پاکلوبوترازول یک تریازول است سنتز اسید جیبرلیک را محدود کرده و جنین زاییCitrus sinensis را افزایش داده است. این ماده کند کننده رشد همچنین اتلاف آب را در گیاهچه ها در مرحله سازگاری کاهش می دهد. تعدادی از کندکننده های تجارتی رشد سطح جیبرلین، اتیلن، و ABA داخلی راکاهش میدهند در حالی که مقدار برخی از سیتوکینینها و پلی آمینها را افزایش میدهند.

 تعدادی از آنتی اکسینها بخصوص 5- متیل – تریپتوفان محرک رشد طبیعی جنینهای سوماتیکی در Sapindus irfoliatus هستند. ولی آنتی اکسین TIAB تشکیل ساقه در ریز نمونه ها جنینی Pinus strobus را افزایش یا کاهش نداد. 7- آزا – ایندول که یک بازدارنده سنتزاکسین است طی ریزازدیاد ی Robinia pseudoacacia تشکیل کالوس پایه را کاهش نداده و نیز در ایجاد و رشد طولی ساقه بی اثر بود.

 جنین زایی در کشت تخمک Citrus medica با کاز اتانولی که بوسیله کشتها آزاد شد به شدت ممانعت گردید. به همین صورت گاز اتانولی که در کشتهای Phoenix dactylfera تولید شده بود مانع جنین زایی در این کشتها گردید.

 3-1-6-8 برخی اوقات تنشها شبیه تنظیم کننده های رشد عمل می  کنند

گاهی سک دوره کوتاه تنش آرام می تواند به اندازه تیمار تنظیم کننده رشد در شروع ریخت زایی و جنین زایی مؤثر باشد تنش باعث می شود که عکس العمل بافت به تنظیم کننده های رشد افزایش یابد. در مقایسه ای که بین اثر اکسین در مقابل تنش در جنین زایی و بلوغ جنین در هویج انجام گرفت مشاهده شد که انواع مختلف تنش مؤثر از 2,4-D می باشند. به نظر می رسد که چنین واکنشی نسبت با ساخت Camp در بافتهای تحت تنش انجام گیرد. نمونه ای خوب از ایجاد رشد بر اثر تنش، جنین زایی دانه گرده توسط شوک سرما است. گاهی تنش باعث کاهش سطح سیتوکینین داخلی می شود.

 کنترل ژنتیکی تولید پراکسیداز ها از جمله IAA پراکسیداز که توسط تنش ایجاد می گردد و در کشتهای سوسپانسیونی Pinus elliottii مطالعه شده است. تنشی که از طریق خارج کردن سلول های Acer pseudoplatanus در تستهای سوسپانسیون سلولی و سوسپانسیونهای واکشت بعدی به محیط کشت جدید حاصل شد به دشت بر فعالیت پراکسیداز در این سلول ها اثر کرد. تنش آب نیز پروتئینهای خاصی را در کشتهای کالوس گونه های مشابه ایجاد کرد. گاهی اوقات تنش ناشی از زخمی شدن همانطورکه در بخش 4-4 نیز بحث شد دارای اثر ریخت زایی است.

 البته اثرات سوء تنش نیز باید مدنظر قرار گیرد گرچه تنش می تواند در موارد خاصی مفید باشد ولی معمولاً همراه با تغییراتی است که زیانبار است.

 3-7-1 کربوهیدارتها

کربوهیدراتها دارای کابردهای متعددی در کشت بافت هستند. آ«ها برای رشد سلول درزمانی که سلول در معرض میزان نوری که خارج از محدوده مؤٍر فتوسنتز باشد و غالباض در کشت بافت بکار می رود قرار می گیرند ضروری هستند. کربوهیدراتها عامل ایجاد فشار اسمزی و گاهی اوقاتت دارای اثرات مشخصی بر ریخت زایی هستند. اکثر کشت ها تا زمانی که جهت سازگاری آمادگی پیدا کنند به یک منبع هیدراته وابستگی دارند برخی محققان معتقدندکه کشت ها در صورتی که روی محیط کشت دارای هیدرات کربن کم رشد می کنند که در معرض سطوح بالای دی اکسید کربن و شدت  نور بالا باشند. این عمل ریزنمونه ها را وادار می کند که جهت تهیه هیدرات کربن به منابع فتوسنتزی خود اعتماد بیشتری داشته باشند تا قند موجود در محیط کشت . موضوع کربوهیدراتها بعنوان منبع انرژی در کشت بافت درختان اخیراً توسط برخی از محققان بررسی شده است. اغلب اطلاعات این بخش از این منابع استخراج شده است، مگر اینکه به صورت دیگری گفته شود.

3-8-1 زغال فعال

زغال فعال در ابتدا با هدف جذب تراوش های ناخواسته به محیط کشت اضافه شد. ما اما با اضافه شدن آن برخی ترکیبات شیمیایی نیز از محیط کشت حذف می شد. ترکیبات فنلی، اکثر اکسینها، سیتوکینها، و اسیدآبسیسیک،( غیر از اسید جیبرلیک) توسط این ماده جذب می شوند همچنین جاذل 5- هیدروکسی متیل فورفورال( محصول سمی که از شکسته شدن ساکارز در طی اتوکلاو شدن تشکیل می شود)، آهن به فرم کمپلکس و روی است. زغال ویتامین های تیامین و اسیدنیکوتنیک اما نه میواینوزیتول و ساکارز را از محیط کشت حذف می کند. بیشترین میزان حذف 2,4-D از محیط کشت توسط زغال فعال در PH پائین و حرارت بالا انجام می گیرد. سرعت جذب  2,4-D از محیط کشت نیمه جامد بسیار کمتراز محیط مایع است. در محیط کشت نیمه جامد بسته به غلظت ژل، 2,4-D زغال جذب ممکن است تا 20 روز قبل از ثبات غلظت 2,4-D صورت گیرد. زغال فعال در غلظت های بین 5%-1/0 ،غلظت 10 میکرومول IAA و IBA را در محیط کشت مایع تا 97% کاهش می دهد.

 3-1-10 Ph  و بافرها

کشتها به pH محیط حساسند با توجه به اینکه pH محیط به سرعتقابل تغییر است خصوصاً اگر کشتها سریع رشد کنند بنابراین آگاهی از pH  اهمیت دارد. بعنوان مثال در  کشتهای Malus و Pyrus ، pH  طی چند هفته بطور تدریجی کاهش یافته و دوباره افزایش پیدا کرد. تغییر سریع pH غالباً بعلت تخلیه آمونیوم از محیط کشت صورت می گیرد(بخش 3-1-3-1)

کنترل قابل قبول pH  با واکشت کردن متوالی بدست می آید. گاهی اوقات بافرهایی برای تثبیت pH به محیط کشت اضافه می شوند امااین کار همیشه مفید نمی باشد. بافرها نباید جذب شوند و یا توسط سلو لها متابولیسم شده ونیز لازم است غیر سمی باشد تعدادی از نمک ها و ترکیبات آلی د رمحیط کشت دارای اثر بافری هستند. بعنوان مثال گلوتامین یک یون قطبی همراه با ظرفیت بافری قوی و با غلظت یونی کم، در محیط کشت است.

 انواع با فرهای که در Ph بین 5/5 و 7 مؤثر باشند با مشکل مواجهند. رایجترین آنها 2- ] N – مورفولینو [ اتان سولفونیک اسید(MES ) است که در غلظت کم در کشتهای جنین زاPicea abise وکشتهای نوک ساقه بکار رفته است. اما در هیچیک از کشتهایی که بافر در آن بکار رفته بود، نسبت به کشتهای بدون بافر، برتری وجود نداشت. از طرف دیگر استفاده از MES همراه با گلوکونات کلسیم بعنوان بافر در محیط کشت P.deltoides  Populus trichocarpa مانع از سوختگی بافت نوک ساقه گردید. pH معمولاً بین 6/5 تا 8/5 تنظیم می گردد اما عکس العمل مطلوب معمولاً در pH  متفاوت از آن ایجاد می شود. بعنوان مثال در Picea abiesدر Ph 5/7-5/6 کشتهایی با جنین زایی بیشتر نسبت به Ph 6-5 بدست آمد. البته در Ph بالاتر مشکل رسوب برخی مواد معدنی بروز می کند. محیط کشت دارای آگار زمانی که pH افزایش یابد بیش ا زحد سفت می گردد که این عمل باعث کاهش شیشه ای شدن بافتهای رشد یافته آن می گردد اتوکلاوکردن Ph محیط کشت را کاهش می دهد.

Ph محیط کشت بر متابولیسم آمونیوم اثر میگذارد و در کشتهای سلولی Acer pseudoplatanus بالارفتن pH از 6 باعث تجمع آمونیوم،گلوتامین، گلوتامات، و آسپاراژین در سلولها گردید.

 تغییردر pH مراحل نمو نیز مؤثر است کاهش pH از 6/5به 4  در جنین زایی هویج باعث رشد به جنین ها در مرحله قبل از کروی شدن تجمع یابند. زمانیکه این کشتها روی کاغذ، صافی حاوی زغال که در سطح محیط کشت دارای آگار قرار گرفته بود منتقل شدند pH  به 7-6 افزایش یافت که احتمالاً به دلیل ترشح موادی از کاغذ بوده است. با افزایش pH ، جنین ها دوباره رشد خود را از سر گرفتند.

 3-1-11 آنتی اکسیدانها

قهوه ای شدن کشتها اغلب معضلی است. قهوه ای شدن در واکنش به برش دهی یا متعاقب آن بروز می کند. علی رغم این که قهوه ای شدن غالباً باعث کاشه سرعت رشد و در نهایت مرگ بافت می گردد اما به این پدیده نباید به دید منفی نگریست در کالوسهای واکشت شده eurolepis × Larix تشکیل ساقه با قهوه ای شدن همراه بود. به همین شکل در Picea abies ریشه زایی و ساقه زایی در کالوسهای قهوه ای با منشاء مگاگامتوفیتهای هاپلوئید انجام گرفت. تظاهر جنینهای   canehora coffea در کالوسهای قهوه ای به همان اندازة کالوسهای سبز صورت گرفت.

برای پرهیز از قهوه ای شدن گاهی اوقات د رحین برش یا در محیط کشت غذایی از آنتی اکسیدانها استفاده می شود در دستجات Pinus brutia افزودن سدیم دی اتیل تیوکابامات(SDD)به اولین محیط کشت و پلی وینیل دپلی پیرولیدون(PVPP ) پلی وینیل پیرولیدون(PVP ) برای کاهش قهوه ای شدن در کشتهای Pinus sylvertris استفاده گردید( هوتولا، 1988) ویتامین Eدر کشت های eurolepis ×Larix ، Eucalyptus rudis و Quercus borealis   قهوه ا ی شدن را کاهش و ریشه زایی را تحریک کرد.  PVP غیرمحلول در کشتهای جوانه Tectona grandis با صدسال قدمت موثر بود. همچنین برای کنترل قهوه ای شدن د رکشتهای Albizzia lebbeck بالغ و Cassia fistula استفاده شد.  گرچه واکشتهای مکرر نیز دارای اثری مشابه بود اسیداسکوربیک در محیط کشت تشکیل ساقه های ثانوی مانع قهوه ای شدن گردید.

 اسیداسکوربیک در محیط کشت بسیار ناپایدار است ما برخی از فرآورده های تجزیه شده آن نقش آنتی اکسیدانی را بخوبی انجام می دهند.

 3-2 ظروف کشت و مواد بسته بندی

3-2-1 ظروف

نوع ظروف استفاده شد ه در بافت اثرات قابل توجهی بر سرعت رشد کشتها، کیفیت ساقه ها، و گیاهچه های تولیدشده روی درجه شیشه ای شدن دارد. در این مورد بویژه حجم ظروف، رطوبت هوا، در فضای بالای کشت درون ظرف و میزن تبادل گازی با هوای بیرون ظرف اهمیت خاصی دارد. در آزماشی یا پنج گونة چوبی بهترین رشد ساقه و ریشه در بزرگترین ظرف مورد آزمایش به دست آمد.

 زمانی که با کشتهایی که دارای رشد کند هستند کار می شود می توان از ظروف کوچک نظیر لوله آزمایش یا پتری دیشهای کوچک استفاده نمود اگر از لوله آزمایش استفاده می شود غالباً بازای هر لوله یک ریز نمونه کشت گردد. مزیت اینکار در آن است که اگر نمونه آلوده شود در صورتی که یک ریزنمونه در لوله کشت شده باشد تنها یک نمونه از بین می رود. در ظروف دارای بیش از یک نمونه، آلودگی بسرعت به ریز نمونه های دیگر سرایت می کند. مزیت دیگر استفاده از لوله آزمایش این است که تعدد زیادی از آنها را می توان در فضای کمی در داخل پایه های مربوطه نگهدار یکرد. بتری دیش ها در حالتی که نیاز به توزیع نور یکنواخت وجود نداشته باشد می توانند برروی یکدیگر قرار داده شوند که با این روش فضای کمتری درون اتاقک رشد اشغال می گردد.  البته محیط کشت داخل پتری به سرعت خشک شده و براحتی آلوده می شود مگر اینکه اطراف آن را با پارافیلم بسته شود. برای کشتهای با رشد سریع خصوصاً آنهایی که به سرعت تشکیل ساقه می دهند، به ظرف بزرگتر نظیر ارلن مایر، بطری، ظروف شیشه ای دهن گشاد یا ظروف پلاستیکی مخصوص همانند مگنتا GA-7 نیاز است. بعنوان مثال ساقه های نا بجا بدست آمنده Malus domestica در لوله آزماش کوتاهتر از ساقه های بلند رشد یافته در شیشه های مخصوص غذای کودک بود ظروف ساخته شدن از پلی پروپلین، پلی کارینات یا پلی وینیل کلراید و ضدعفونی شده با پرتوگاما نیز کاربرد عمومی دارد. با این حال اگر ظروف ممکن است کمی مواد سمی قرار آزاد کنند که مانع رشد کشتهای حساس گردند استفاده از فیل فلوروکربن پلیمری در ساخت ظروف کشت جعبه ای شکل را توصیه کرده است.این ظروف اتوکلاو شده، با محیط کشت پرشده و ریزنمونه ها در آن قرارداده می شوند سپس ظروف خمیده شده و با حرارت مسدود می گردند. بنابراین کلیه تبادلات گازی از طریق دیواره پلاستیکی ظرف انجام شده و از خطر آلودگیهای میکروبی به میزان زیاد می کاهد.

 برای کشتهای سوسپانسیون سلولی انواع مختلفی از ظروف کشت متداول هستند. بطریهای استوانه ای و فلاسک های دهان باریک برای روش گردان استفاده می گردد. گاهی اوقات ارلن مایرهایی که استقرار خوبی روی کف ندارند روی دستگاه شیکر( دورانی) افقی استفاده می شوند. در کشتهای سوسپانسیون در مقیاس زیاد ظروف کاملاً اختصاصی( بیورآکتورها ) بکار می روند. مسائل اصلی در بیوآکتورها تبادل گازی، کنترل pH حذف محیط قدیمی و جایگزین کردن محیط کشت جدید است. تبادل گازی از طریق تکان دادن محیط مایع با قراردادن ظرف کشت روی دستگاه شیکر یا رولر انجام می گیرد. هوادهی تعداد زیادی از ظروف معمولاً توسط انواع مخلتف لزرش یادمیدن حبابهای هوا فاقد آلودگی به داخل محیط کشت انجام می گیرد. مشکل اصلی در لرزش، آسیب دیدن سلولهاست که در اثر برخورد آنها با یکدیگر اتفاق می افتد. سوسپانسیون های سلولی به خسارت ناشی از برخوردها حساس هستند این خسارت در اواخر مرحله رشد نمایی و ابتدای مرحله سکون بیشتر از سایر مراحل است.  از میان ن چندین نوع ابزار دوار آزمایش شده کمترین خسارت مربوط به نوعی بوده است که دارای بازوی برزگتری برای لرزش بوده است. ایجاد لرزش توسط هوا نیز خسارت ناشی از برخورد را کاهش می دهد . اما هوادهی نامناسب می تواند مشکل آفرین باشد. در بیورآکتور های بزرگ برای کاهش خسارت برخورد سلول ها غالباً آنها را درمهره های ژله ای شده از انواع مختلف فرو برده و بدین نحو آنها را ثابت نگه می دارند.

 بیورآکتور ها به نحو گسترده ای در کشت سلولهای Acer pseudoplatanus استفاده می شوند.کاربرد نوع جدیدی از تکان دهنده های سلولی در سوسپانسیون های سلولی Pinus elliottii  باعث رشد خوبی شده است. Phoenix dactylifera در سیستم کشتی که توسط رایانه بطور خودکار کنترل می شد کشت شدند در این سیستم بافت ها در مدت کوتاهی( 12 مرتبه در روز) در محیط کشت مایع جدید غوطه ور می گردیدند. افزایش وزن بافت های Phoenix در این سیستم 2/3 برابر بیش از زمانی بود که روی محیط کشت دارای آگار در لوله آزمایش کشت شده بودند. سوسپانسیون گره های Populus در بطری های استوانه ای بزرگ کشت شدند.

 3-2-2 دربندها

دربندها روی ظروف قرار گرفته و مانع ورود میکروارگانیسم ها به درون ظرف می گردد. بعلاوه سرعت تبادل گازی و رطوبت هوای دداخل ظرف با نوع دربند مورد استفاده کنترل می شود. رطوبت بالا و عدم تبادل گازی و در نتیجه تجمع اتیلن درون ظرف ا علل رایج شیشه ای شدن است.

 کشت سوسپانسیون های سلولی Pica glauca درون ظروف کاملاً  سربسته باعث تجمع  و اتیلن و جلوگیری از جنین زدای سوماتیک گردید. البته اثرات سرعت کم تبادل گازی همیشه منفی نیست تجمع اتیلن و دی اکسید کربن در ظروف کشت سربسته Pinus radiate باعث ایجاد جوانه در ریز نمونه ها شد. سطح دی اکسید کربن و تجمع اتیلن در ظروف کشت های soulangeana × Magnolia به نوهع ظرف و چگونگی بسته شدن در آن بستگی داشته است. سطوح بالای دی اکسید کربن به مقدار 14% در این ظروف اندازه گیری شد. تجمع اتیلن در ظروفی که در آنها محکم بسته شده باشد می تواند در برخی گاهان در شرایط این ویترو مانع تغییر مرحله جوانی به بلوغ گردد. افزودن مواد جذب کننده اتیلن( پرکلرات جیوه ) می تواند مانع این تغییر شود. تجمع دی اکسیدکربن و اتیلن در فلاسکهای کشت در کشت های Hevea brasiliensis  مانع جنین زایی سوماتیکی گردید. این بازدارندگی با جذب دی اکسید کربن توسط هیدروکسید پتاسیم و اتیلن توسط پرکلرات جیوه از بین رفت. جلوگیری از سنتز اتیلن از طریق افزون آمینواکسی استیک اسید به محیط کشت سرعت جنین زایی سوماتیکی را بهبود بخشیده است.

رطوبت نسبی تحت تأثیر سرعت تبادلات گازی و میزان سفتی محیط کشت غذایی است. زمانی که سرعت تبادلات گازی بالا و محیط کشت غذایی سفت باشد رطوبت نسبی پایین خواهد بود. چنین شرایطی برای حالتی که شیشه ای شدن مشکل ایجاد می کند، قابل توصیه است. البته زمانی که رطوبت نسبی پایین باشد محیط کشت غذایی به سرعت خشک می شود و بنابراین به واکنشهای مکرر نیاز است. برای پرهیز از شیشه ای شده همیشه نیاز به حفظ مداوم تبادلات گازی در سطح بالا نیست. در برخی کشتها بمنظور پرهیز از شیشه ای شدن می توان از یک تبادل هوای سریع در مدت زمان کوتاه بلافاصله پس از هر واکشت واز تبادل کم گازی در زمانهای دیگر استفاده کرد. ترکیب ایده آل یعنی سرعت پایین خشک شدن محیط کشت و رطوبت نسبی پایین درون ظرف را میتوان از طریق سردکردن کف ظروف کشت سربسته انجام داد. با سردکردن کف ظرف محیط کشت به 19 درجه سانتیگراد در حالی که دمای هوای داخل ظرف سربسته در 24 درجه سانتیگراد نگهداشته می شود، رطوبت نسبی درون ظرف تا 74% کاهش می یابد. کاهش رطوبت نسبی محرک جریان تعرق بوده و بنابراین باعث تحریک انتقال مواد معدنی درون ساقه می شود. این عمل اثر قابل توجهی بر کیفیت ساقه داشته و در نتیجه بر توانایی ساقه برای تولید ریشه و سازگاری پس از انتقال به خاک نیز مؤثر است. زمانیکه چرخه روشنایی – تاریکی همراه با دمای پائین در مرحله تاریکی بجای مرحله روشنایی بکار می رود. رطوبت نسبی درون ظرف طی دوره تاریکی ببشتر خواهد بود.

 انواع متفاوتی از نوارها جهت بستن ظروف برای کاهش دادن جریان هوا بکار می رود. از میان آنها نوعی برتری دارد که نفوذپذیری آن به هوا زیاد ولی به آب کم باشد. پارافیلم که مصرف آن متداول است نسبتاً به گاز نفوذ پذیر است. جنین های جداشده Ginkgo biloba  که روی محیط کشت وایت کشت شدند در صورتی که سر ظرف با پنبه بسته می شد جوانه می زدند اما زمانی که با پارافیلم بسته می شدند کالوس تولید می کردند. بستن در ظرف با پارافیلم در کشتهای 5 گونه چوبی به کاهش رشد ساقه منجر گردید.

 فصل چهارم

جمع آوری نمونه گیاهی نحوة استریل کردن، برش و کشت آن

4-1 وضعیت مواد گیاهی

موفقیت یا عدم موفقیت ریز ازیادی  گونه های درختی ، اغلب به وضعیت مواد گیاهی در زمان جمع آوری بستگی دارد این امر به ویژه زمانی صادق است که ریز نمونه ها از درختان کشت شده در مزرعه بدست آمده باشد وضعیت فیزیولوژیکی بافتها با فصل،محل آن در درخت و عوامل اقلیمی فرقی میکند. بعنوان مثال مقدار نیتروژن موجود در شاخ و برگ، تحت تأثیر الگوی بارندگی قرار دارد.

 نور روی تجمع ذخایر اثر داشته و تنش ABA و میزان هورمونهای دیگر را در بافتها تغییر میدهد. بعلاوه عوامل محیطی بر میزان آلودگی میکروبی بافتها نیز مؤثر است.

 4-1-1 مواد گیاهی گلخانه ای

بدلیل غیر قابل پیش بینی بودن اثرات محیط آزاد بر وضعیت فیزیولوژیکی گیاهان، بسیاری از محققان ترجیح میدهند از مواد گیاهی رشد یافته در گلخانه استفاده نمایند. در گلخانه با استفاده از نور،دما، و کوددهی مناسب می توان بنیه گایه را در حد بالایی حفظ کرد بعلاوه در گلخانه، کنترل دقیق حررت و بیماریها آسانتر از مزرعه است. به همین منظور ریز نمونه های حاصل از گیاهان گلخانه ای اغلب آلودگی کمتری از گیاهان مزرعه ای دارند.

 گیاهچه های گلدانی را می تون به آسانی در گلخانه یا اتاقک رشد بعمل آورد. متأسفانه برای رشد درختان بزرگ در شرایط طبیعی، چنین عملی میسر نیست مگر اینکه از بخشهای کوچک آنها مثل قلمه های رییشه دار یا پیوندکهای پیوند شده روی پایه های جوان استفاده می شود. بجای استفاده از قلمه های ریشه دار یا پیوند ها ، روش گرفتن قلمه در زمانی است که جوانه ها آماده بازشدن باشند. قلمه ها در آب یامحلولهای غذایی در شرایط گلخانه ای یا اتاقهای رشد قرار داده می شوند تا زمانی که به مرحله نمو مناسب برای برش زدن ریز نمونه برسند. این روش برای قلمه های حاصل از Coffea robusta بالغ اعمال شده  قراردادن قلمه های Castanca dentate در محلول حاوی قند، هیدروکسی کینولین، ماده های شیمیایی با فعالیت ضدمیکروبی، ساقه های بدست آمد که از آن ریز نمونه در صورتی که قلمه های قبل از رشد در محلول هیپوکلریت شستشوشده باشند کاهش می یافت. برای تهیه ریزنمونه از ساقه های فعال و بالغ Oxydendrum arboreun قطعات ساقه یا جوانه های در حال خواب در محلول آبی در شرایط گلخانه تقویت شدند.این محلول حاوی ساکارز، هیدروکسی کینولین و سولفات آلومینیوم بود. پس از بازشدن جوانه ها، ساقه های جدیدی بطول 10 تا 20 سانتیمتر تولید شد. ریزنمونه های دارای گره این ساقه ها قطع ودر شرایط این ویترو کشت شدند. همچنین ریزنمونه های مناسبی از قلمه های Betula pendula که در آب( بدون افزودن هیچگونه مواد) قرار داده شده بودند بدست آمد. قراردادن جوانه های Abies balsamea در آب همراه با EDAT ، قبلاز برش و کشت این ویترو و ریخت زایی را تحریک کرد. برای بدست آوردن ریزنمونه هایی که نسبتاً عاری از آلودگی باشند، خشک بودن قسمت های هوایی گیاه ضروری است.وچنین شرایطی غالباً ازطریق آب دادن گیاه از قسمت تحتانی اعمال می شود. متأسفانه نتیجه این عمل در گیاه و در ریزنمونه های با موقعیت فیزیولوژیکی خوب، رضایت بخش نمی باشد. برای کاهش آلودگی در کشت ساقه، از ریز نمونه ها Eucalyptus grandis با 18ماده رشد در شرایط گلخانه ای استفاده شد. این گیاهان، جهت تحریک رشد هرس شدند برای حفاظت ساقه های جدید در حال رشد از آلودگی های موجود در هوا،از روش قراردادن ساقه ها در پاکت های شفاف استفاده شد.

 شرایط نوری هم دارای نقش است قراردادن گیاهچه های Betula pendula در معرض روز کوتاه با شدت نور کم به مدت 2 ماه قبل از برش ساقه و کشت قهوه ای شدن را کاهش داد و تولید ساقه نابجا را تحریک کرد. البته ریشه زایی ساقه های نابجای بدست آمده از ریز نمونه های گیاهانی که بدین صورت تیمار شدند کندتر از آنهایی بود که در معرض شرایط فتوپریودی روز بلند قرار گرفتند. گاهی اوقات گیاهان را قبل از برش ریزنمونه در شرایط تاریکی نگهداری می کنند. بعنوان مثال گیاهان Citrus mitis به مدت 10-12 روز قبل از برش ریزنمونه در شرایط تاریکی نگهداری شدند. زمانیکه درختان در خواب هستند قبل از آنکه ریزنمونه های آنها به شرایط این ویترو منتقل شوند شاید لازم باشد تا این خواب شکسته شود سرمادهی Malus domestica پیوندی قبل از برش ریزنمونه جوانه به بهبود طویل شدن ساقه در این ویترو منجر شد.

4-1-2 مواد گیاهی مزرعه ای

مطلوب نمودن مواد گیاهی موردنیاز جهت کشت یافت، همیشه در گلخانه یا اتاقک رشد میسر نیست در چنین مواردی مجبور به استفاد از گیاهان مزرعه ای بوده و ریز نمونه ها از نظر یکنواختی کمتر و غالباً آلودگی بیشتربرخوردارند.

 جنین هایی که از بذرهای تولیدی درشرایط مزرعه جدا شده تحت تأثیر شرایط اقلیمی و موقعیت آنها در داخل درخت هستند وضعیت شیمیایی جنینها و مگاگامتوفیتهای Pinus banksiana وابسته به شرایط اقلیمی است. این حالت احتمالاً بر رفتار آنها در این ویترو اثر می گذارد. در بررسی انجام شده مگاگامتوفیتهای Larix decidua تهی شده از بخش میانی مخروطهای ماده بزرگتر و حساس تر  از بخشهای فوقانی یا تحتانی مخروط در کشت این ویترو بودند.جنین های جداشده بلوطهای Quercus robur که از نزدیک رأس تاج جمع آوری شده بود بهتر از آنهایی بودند که از سایر بخشهای بلوط بدست آمده بودند.

 4-3-1 اثر ژئوتیپ

سهولت ریز ازدیادی یک گونه اغلب بسته به نوع ژئوتیپ متفاوت است. بنابراین زمانی که با گونه ها ی که برای ریز ازدیادی مشکل دارد مواجه می شویم. ژئوتیپهای زیادی از آنگونه مورد آزمایش قرار می گیرد تا مشخص شود سودمندترین آ«ها در این ویترو کداام است زمانی که از درختان و گیاهچه ها استفاده می کنیم می توانیم از همه آنها برای آزمایش ریزنمونه تهیه کنیم. بنابراین می توانیم تعیین کنیم کدامیک از این گیاهان بهترین منبع نمونه است تا آن در مراحل بعدی استفاده کنیم. زمانی که از جنین بعنوان دهنده ریزنمونه استفاده می کنیم نمونه گیری بعدی از منبع دهنده مشابه امکان پذیر نیست بنابراین مجبور خواهیم بود در ابتدا لاین سلولی هر ژئوتیپ

 را بدست آوریم. پس از انتخاب مفیدترین لاین سلولی، این لاین سلولی میتواند در آزمایشهای بعدی استفاده شود. کارکردن با ژئوتیپ در آزمایشهای متوالی قابلیت تکرار پذیری آزمایش را بهبود می بخشند.

تنوع در عکس العمل ژئوتیپی در داخل گونه ها می تواند بسیار زیاد باشد. در کشتهای حاصل از Pseudotsuga menziesii 17 ساع سرعت تشکیل ساقه بین درختان با مبدأهای مختلف و حتی دربین درختانی با مبدأ مشابه به مقدار زیادی متفاوت بود. درصد ریشه زایی ساقه های تکثیر شده Pinus radiate بالغ بطور قابل توجهی بسته به ژئوتیپ متفاوت است. در آزمایشی در درختان Larix  عکس العمل انگیزش ساقه در درختان یک گروه با مبدأ مشابه بطور معنی داری متغیر بود. همچنین مبدأ در جنین زایی غیر جنسی Picea glauca مؤثر بود در آزمایش 16 کلون از Populus deltoids چهار کلون بطور معنی داری بهتر از دیگران واکنش نشان داد و در بین آنها 6 کلون واکنش نشان نداد. به همین صورت اثر قابل توجه ژئوتیپی در آزمایشی با 15ژئوتیپ Morus alba گزارش شده است سهولت تکثیر Quercus robur بالغ بسته به ژئوتیپ داخل گروهی با مبدأ مشابه متفاوت بود.

 4-2 جمع آوری و نگهداری

زمانی که گیاهان دهدنده ریز نمونه در گلخانه یا اتاقک رشد پرورش می یابند گیاهان  در  تمام طول سال در مرحله مناسبی از رشد می توانند در دسترس باشند اما ریزنمونه های حاصل از درختان فقط زمانی برای ریز  ازدیادی در شرایط مطلوب هستند که به موقع جمع آوری شوند. نگهداری مواد گیاهی جمع آوری شده در زمان مناسب طول دوره ای را که از آن می توان استفاده کرد افزایش می دهد.

گرفتن قلمه های نرم یا شاخه از درختان سبب تنش رطوبت و زخمی شدن می گردند. برای کاهش این تنشها توصیه میشود که به جای قلمه های نرم یا تک جوانه، شاخه ها جمع آوری گردند. مواد جمهع آوری شده برای پرهیز از تلفات رطوبتی معمولاً در داخل کسیه های پلاستیکی حمل و نقل می گردند. برای نگهداری مواد جمع آوری شده در آزمایشگاه راههای متعددی وجود داردو متداولترین روش نگهداری در کیسه های پلاستیکی  و در دمای 4 درجه سانتیگراد در شرایط تاریکی است. البته یان روش ایده آل نیست. مواد ناخواسته از جمله اتیلن در داخل کیسه ها تجمع خواهد یافت و سطح هیدراتهای کربن در بافت و سطح هیدراتهای کربن در بافت افت خواهد کرد. متابولیتها تغییر خواهند کرد و ممکن است کلروپلاستها و تشکیل خواهد شد مواد گیاهی خواب نسبت به آنهایی که فعال هستند اغلب کمتر تحت تأثیر آلوده کننده ها، قرار می گیرند. کنترل محدوده آلودگی با کاربرد قارچ کشها، امکان پذیر است. شاخه های برخی از گونه ها در کیسه های پلاستیکی در دمای حدود 4 درجه سانتیگراد برای چندین ماه بدون افت در قابلیت زنده ماندن نگهداری شده اند(C.crenata × Castanea sativa ) البته در اکثر گونه ها فقط در صورتی که شاخه ها برای مدتی کمتر از یک یا چند هفته نگهداری شوند خواهند توانست ریز نمونه فعال تولید کنند.

 در چند مورد سرمای دوره نگهداری، ریخت زایی را تحریک کرده است. قراردادن بساکهای Licium chinensis در دمای پایین برای 5 روز قبل از کشت  فراوانی ایجاد چنین دانه گرده را سه برابر کرد. در آزمایشی بهاره کردن مخروطهای نابالغ ماده Picea abits در 4 درجه سانتیگراد به مدت 12-42 روز قبل از برش مگاگامتوفیتها، تشکیل کالوس را تحریک کرده است. نگهداری شاخه ها Coryfus avellana بمدت 3 ماه در شرایط سرما و بدنبال آن قراردادن آنها در آب توانایی تشکیل ساقه از ریزنمونه های حاصل از ساقه های قرار داده شده در آب را افزایش داد. در این روش میزان آلودگی و قهوه ای شدن ریزنمونه ها نیز کاهش یافت. ریزنمونه هایی که از شاخه های سبز در حال رشد C.crenata × Castanea sativa که درم ماه های می و ژوئن جمع آوری شده بودند. نسبت به ریزنمونه هایی که از جوانه های در حال خواب در زمستان جمع آوری شده و به مدت سه ماه در 4 درجه سانتیگراد نگهداری و متورم شده از وضعیت مناسب کمتری برخوردار بودند. ریز نمونه های ساقه Abies balsamea در صورتی که از ساقه های باریکی که به مدت 6 هفته در سرمانگهداری شده بدست می آمدند نسبت به آنهایی که از ساقه تازه تهیه شده از نظر ریخت زایی مناسب تر بودند.

 4-3- ضدعفونی سطحی

ضدعفونی سطحی مواد گیاهی جوان معمولاً مشکل نیست. البته اگر از درختان مسن استفاده شود،گاهی اوقات ریزنمونه های آلوده مشکل جدی محسوب می شوند مگراینکه این درختان ساقه های جوان تولید کنند بعنوان مثال همه ریزنمونه های حاصله از شاخه های 5 ساله Eucalyptus grandisپس از ضدعفونی سطحی آلوده  بودند در حالی که بیش از نیمی از نمونه هایی که از ساقه های جوان گرفته شده اند، گاهی اوقات نسبت به آنهایی که از قسمتهای پیرتر شاخه گرفته شده اند ضدعفونی ساده تری دارند. همچنین میزان آلودگی سطحی بسته به شرایط اقلیمی تعیین می گردد. تهیه ریزنمونه از گیاهانی که در آب و هوای مرطوب گرمسیری رشد می کنند بسیار مشکلتر از محیطهای سردتر یا خشک تر است.

 میزان آلودگی غالباً به زمان جمع آوری مواد نیز بستگی دارد. بافتهای جداشده از جوانه های 10 تا 40 ساله درختان مزرعه ای Pinus sylvestris  و دسته های برگ از قلمه های ریشه دار Pinus Pinaster در صورتی که در زمستان جمع آوری شده باشند بیشترین آلودگی را دارند. به همین صورت مشکلات آلودگی در تعدادی از گونه های سخت چوب اروپایی( چالویا، a 1987) و همچنین Caria papaya که در زمستان جمع آوری شده بودند بسیار شدیدتر از آنهایی بود که در سایر فصول جمع آوری گردیده بودند.

 4-4 برش و انتقال بافتها

متداولترین ریزنمونه ها شامل جنین،لپه، جوانه، ساقه، و شاخ و برگ جوان هستند. زمانی که ریزنمونه های نسبتاً بزرگ برش زده می شوند، مواد گیاهی ضدعفونی شده می تواند با اسکالیل استریل در یک محیط مرطوب به سادگی برش زده شود؛ بعبارت دیگر در لایة نازکی از آب استریل یا روی کاغذ صافی استریل مرطوب برش انجام میی گیرد البته زمانی که ریزنمونه های کوچک نظیر مریستم فوقانی بکار می روند. برش مشکلتر است، برای به حداقل رساندن عکس العمل زخم بایستی از اسکالیلی استفاده کرد که تا حد ممکن تیز باشد. یک اسکالیل کند گرچه ممکن است تمام سلولهایی را که در تماس با لبة آن است برش دهد ولی به تعداد زیادی از سلولهای مجاور آسیب خواهد رسانید و بنابراین سبب شدت عکس العمل زخم می شود. زخم تمایز و تقسیم سلولی و در پی آن تشکیل کالوس را تحریک می کند.در جایی که تمایززدایی و تشکیل کالوس مطلوب نیست تا آنجا که ممکن است از ایجاد زخم باید اجتناب کرد. میزان کالوس زایی در کشتهای Citrus limon با میزان جراحت ریز نمونه ها همبستگی داشت.

 البته ایجاد زخم می تواند دارای اثرات سودمند نیز باشد. همچنین گاهی اوقات محرک ریخت زایی است. در برخی موارد زخمی کردن ممکن است مؤثرترین راه برای به فعلیت رساندن قابلیت های سلول باش.

 4-5 قهوه ای شدن طی دوره کشت و واکشت

قهوه ای شدن بافتها متابولییسم آنها را به صورتهای مختلف تحت تأثیر قرار میدهد. دد در کشتهای کالوس Pinus sylverstris شروع قهوه ای شدن با افزایش سنتز پروتئین و نشاسته و کاهش تولید همراه بوده است. پس از آنکه قهوه ای شدن شدیدتر گردید، سنتز پروتئین کاهش یافته و تخریب بافت شروع شد. قهوه ای شدن بافتها  اتوکاتالیزور اشت. تراوش های فنلی موجب جراحت شده و در نتیجه باعث افزایش تراوش می شود که منجر به افزونی قهوه ای شدن می گردد. برای جلوگیری از تراوشها ، می توان زغال اضافه کرد. اما زغال هم از طریق جذب هورمونهای رشد مانع تأثیر آنها می شود.

 متداولترین روش برای ممانعت از قهوه ای شدن و کشت مکرر است. با انتقال کشتها در فواصل زمانی، قسمتهای مرده بافتها را می توان قبل از آنکه سلامتی سلولها را با مواد فنلی سمی خود از بین ببرند حذف کرد. ساختن مکرر محیط کشت های جدید نیزمانع تجمع شدید سلولهای مرده ای می شود که بداخل محیط کشت نشست می کند. در بعضی موارد برای جلوگیری از سمیت شدید باید مواد غذای در فواصل دوره ای کوتاه جایگزین شود. برای پرهیز از تغییر رنگ محیط کشت کشتهای ساقه Juglans در هفته اول روزانه و بعد تا رسیدن ساقه ها به طول حداقل 2 سانتیمتر هفتگی به محیط جدید منتقل شدند.

4-6-  شرایط محیطی انکوباسیون

عوامل مهم در محیط فیزیکی کشتها عبارتند از:دما،نور و تبادل گاز

4-6-1 دما:

 ریز نمونه های درختان مناطق معتدل معمولاً بهترین رشد را در دماهاهی 20 تا 28 درجه سانتیگراد دارند برای ریز نمونه های درختان اقلیمهای گرمتر، دمای مطلوب اغلب در داخل نیمة بالایی این دامنه قرار می گیرد. کشتهای برخی گونه های در ختی گرمسیری به دما بسیار حساس هستند. کشتهای جنین زا Elaeis guineensis زمانی که دما به کمتر از 20  درجة سانتیگراد کاهش یافت دچار آسیب دیدگی سرمازدگی شدند.

 بافتهای برخی از گونه های در ختی در این ویترو در صورتی که دمای شب بین 5 تا 10 درجه  سانتیگراد پائین تر از دمای روز باشد سریعتر رشد می کنند. البته کشتهای جنینی و لپه ای تعدادی از گونه های سوزنی برگها دمای ثابت روز و شب ساقه های نابجای بیشتری تولید کردند. طویل شدن ساقه و رشد انشعابی در کششهای Pseudotsuga manziesii در کشتهایی که در معرض دمای ثابت 25 درجه سانتیگراد قرار داشتند بیشتر از  آنهایی بودند که در رژیم 17/25 درجه سانتیگراد شب/روز بودند. ایجاد ساقه نابجا در سوزنی برگها اغلب نیازمند دمایی بیشتر ازدمای طویل شدن ساقه است.

برای ریشه زایی ساقه های نابجای بسیاری از سوزنی برگها، دمایی در حدود 20 درجه سانتیگراد مناسب می باشد برای برخی گونه های سوزنی برگها، ریشه زدایی در دمای پایین تر مطلوب است؛ بعنوان مثال ریشه زایی ساقه های ریز ازدیاد شده Pinus strobus در دمای 17 درجه سانتیگراد بسیار بهتر از دمای  26  درجه سانتیگراد بود. برای ساقه های ریزازدیاد شده گونه های سخت چوب، دمای مناسب برای ریشه زای ی اغلب بیشتر( 25 – 20 درجه سانتیگراد) است.

 در آزمایش اثر دماهای ثابت مختلف بین 12و 40درجه سانتیگراد روی کشتهای سوسپانسیونی Theobroma cacoa ، رشد بین 25 و 35 درجه سانتیگراد مشاهده شد که 30 درجه سانتیگراد دمای مطلوب بود در پایین ترین دمای آزمایش شده، زنجیره های اسیدهای چرب اشباع شده در سلولها انباشته شده بودند.

 4-6-2 نور

نور در طیفی از فعالیت های  نمو گیاه دخالت دارد و بعنوان منبع انرژی در فتوسنتز بکار می رود. بعلاوه برتمایز و ریخت زایی سلول اثر میگذارد. فتوپریود خواب، جوانه زنی و غیره را کنترل می کند. نور غالباً عکس العملهایی مشابه آنچه توسط سیتوکینینها بدست می آید تولید می کند. نور همچنین تشکیل نیترات ردوکتاز و بعد کاهش نیترات را دربرگ تحریک می کند. در نتیجه گیاهانی که بطور دائم تحت شدت نورکم رشد کنند تمایل به تجمع نیترات دارند. بجز زمانی که ساقه ها قبل از انتقال به خاک درحال سازگاری باشند، شدت نور به کار رفته برای تولید فتوسنتزی بسیار کم است.هیدرات کربن محیط کشت مانع فتوسنتز است.

رایج ترین منبع نور، لامپهای فلورسنت هستند. لامپهای لوله ای به دلیل اینکه دارای مقداری نور قرمز در طیف خود هستند ارجحیت دارند( Gro-lux ) لامپهای فلورسنت به علت اینکه نور قابل رؤیت را با باند پهن تری نسبت به لامپهای التهابی تولید می کنند متداولتر هستند. بعلاوه آنکه حرارت کمتری تولید می کنند و این چیزی است که آنها را بعنوان منبع نور در فضای بسته از قبیل اتاقک رشد ارجحیت میدهد.

 تکثیر کلونی

5-1 اصول کلی

5-1-1 چرا کلون کردن؟

برای ازدیاد گیاهان دو روش وجود دارد، جنسی و رویشی تکثیر جنسی اساس به نژادی را فراهم می کند. مزیت به نژادی این است که وقتی ترکیب خوبی تشخیض داده شد، تعداد زیادی بذر اصلا شده ژنتیکی را می توان با قیمت پایین تولید کرد. بذرهای حاصله از سطح باروری خوبی برخوردار خواهند بود. متأسفانه برای بسیاری ا ز این گونه ها ازدیاد کلونهای انتخابی نمونه های بالغ، گاهی اوقات یک اخبار است. استفاده از کلونها در صورتی که همراه با به نژادی باشد. می تواند بسیار مؤثر باشد. همچنین از کلون کردن برای مطالعه اثرات ژئوتیپ و محیط روی فنوتیپ استفاده می شود.

 و جزء لازم در اکثر روشهای مهندسی ژنتیک است.

 5-1-2 مشکلات مربوط به کلون کردن

تکثیر به روش کلون کردن می تواند  همراه با مشکلاتی باشد. قبل از تصمیم گیری در مورد استفاده از روشهای  جنسی و یا کلون در برنامه های اصلاحی درختان باید محدودیت های زیر را مورد توجه قرار داد. 1) کلون اغلب وابسته به ناحیه خاص هستند و تنها در مکانهای مشابه مکانی که منشأ اولیه آنها در آنجا یافت شده بخوبی رشد می کنند. از آنجایی که در احیای جنگل معمولاً نیاز به کاشت نهالهایی است که در مناطق  مختلف خوب رشد کنند لازم است کلونهایی با سازگاری گسترده که دارای صفات رشدی خوب در طیف وسیعی از مکانها هستند، انتخاب شوند. 2) برخی کلونها که بطور غیرجنسی بیش از چند نسل( در بعضی موارد برای قرنها) باقی مانده اند. به دلیل تجمع تدریجی عوامل بیماری زا در بافتها از بین رفته اند. این مشکل غالباً در زیرازدیادی دارای شدت کمتری از سایر فرمهای کلون کردن است، زیرا اغلب با ریزازدیادی عوامل بیماری زا حذف می شوند. 3) یکنواختی ژنتیکی ممکن است خطرناک باشد. 4) کلونهای که از طریق ریشه زایی قلمه ها زا ریزازدیادی تولید می شوند همیشه کاملاً مشابه والدین نیستند. 5) سهولت کلون کردن اغلب در داخل گونه ها متغیر است.

 برخی ژئوتیپیها به سادگی کلون می شوند در حالیکه در بقیه ممکن است عکس آن اتفاق بیفتد.

 5-1-3 تکنیک های کلون کردن رایج در مقابل کلون به روش این ویترو

انجام کلون از طریق پیوندزدن روی پایه جوان معمولاً روی درختان با هر سنی می تواند انجام شود. این روش زمانی مؤثر است که فقط تعداد کمی افزونه [9] نیاز باشد و زمانیکه انحراف فرم درخت نسبت به گیاهی که کلون از آن به دست می آید مشکل ساز نباشد. پیوندزدن اغلب به تولید بذر و به نژادی باغهای میوه و تکثیر درختان میوه محدود می شود. ریشه زایی قلمه ها مؤثر است اما اغلب به مواد گیاهی جوان یا بالغ محدود می شود درمقابل زیرازدیادی هنوز هم گاهی اوقات برای گیاه اولیه در سنی که قلمه های آن( هیچ) توانایی ریشه زایی ندارند امکان پذیر است. با این حال در برخی گونه ها- بطوراخص سوزنی برگها-ریزازدیادی فقط برای مواد گیاهی بسیار جوان امکان پذیر است. بعلاوه به جز روشهایی که برای جنین زایی سریع در دسترس است، میزان ریزازدیادی کمتر از آن است که از طریق ریشه زایی قلمه به دست می آید. بعنوان مثال از طریق تقویت گیاهچه ها و قلمه های ریشه دار شده Larix در یک گلخانه 400- 500 افزونه در سال از هر گیاهچه می توان تولید کرد( پارک و فولر، مذاکرات شخصی) این تعداد برای اکثر سوزنی برگها از طریق تشکیل ساقه جانبی یا نابجا در جنین با قلمه های حاصل از گیاهچه بازهم بیشتر است. سایر روش هایی که در حال حاضر مؤثر از تکثیر به طریق تشکیل ساقه جانبی یا نابجا هستند بدین قرارند: گیاهان یکساله Larix deciduas ، ابتدا سرزنی شده و سپس ساقه های آنها وادار به رشد افقی روی سطح خاک شدند. اینکار باعث تحریک تعداد زیادی جوانه های جانبی شد به دنبال آن تعداد زیادی ساقه برای ریشه زایی متداول قلمه ها فراهم شد. اسپری کردن گیاهچه ها با BA می تواند به تعداد زیادی ساقه منجر شود که قابل استفاده برای ریشه زایی است. نکات زیر در ارتباط با اهمیت ریزازدیادی وجود دارد: 1) برخی در ختان ساقه های رویشی کمی برای ریشه زایی قلمه ها با پیوندزدن تولید می کنند.این دسته شامل Simmondsia chinensis تولید برخی ارقام پاکوتاه درختان میوه دار و خصوصاً درختان تک لپه می شوند2) ریزازدیادی به واریته های درختان میوه که قبلاً از طریق پیوندزدن روی پایه ای با ژئوتیپ متفاوت تکثیر شده است در صورتی که ریشه های خودش مطلوب باشد امکان رشد روی آنرا فراهم میکند.این کار دارای این مزیت است که از مشکل ناسازگاری اجتناب می شود اما دارای عیب عدم بهره مندشدن از کیفیت های خوب موجود در پایه است( پاکوتاهی، مقاومت به بیماری) 3) کشت بافت را می توان برای دوره های زمانی طولانی در دمای پایین نگهداری کرد این کار در برنامه های به نژادی درختان و نگهداری طولانی مدت ژرم پلاسم استفاده می شود. 4) عوامل بیماریزا را اغلب می توان از طریق ریزازیادی گونه ها یا کلون ها حذف کرد 5) ریزازدیادی جزء ضروری اکثر برنامه های مهندسی ژنتیک است 6) ریزازدیادی روشی انعطاف ناپذیر از ریشه دار کردن قلمه ها است. بدین معنی که طیف وسیعی از عوامل محیطی شیمیایی را می توان به سادگی تحت شرایط کنترل شده اعمال نمود. 7) روشهای جنین زایی سوماتیکی برای تعدادی از گونه ها بسرعت در حال توسعه است و ازدیاد سریع کلونی در آینده نزدیک را حداقل برای برخی از گونه ها نوید میدهد 8) ریزازدیادی تجارتی در چندگونه به مواد گیاهی جوان محدود شده است. پیشرفت های اخیر مؤید این مطلب است که این محدودیت برای برخی گونه ها به زودی از بین خواهد رفت.

5-4-1 انواع ریزازدیادی

سه نوع اصلی ریز ازدیادی عبارت اند از: رشد طولی ساقه جانبی، اندام زایی ( ریخت زایی) و جنین زایی

5-1-4-1 رشدطولی – ساقه جانبی

ر شد طولی ساقه جانبی زمانی انجام میشود که جوانه های جانبی که بطور معمول غیرفعال اند از غالبیت انتهایی رهایی یابند این کار بیشتر از طریق تغییر هورمونها

( اساساً سیتوکینیها) در محیط کشت غذایی اعمال می شود.این روش تکثیر برای گونه های چوبی سخت رایجتر از سوزنی برگهاست. این روش به دلیل اینکه معمولاً ساده ترین روش قابل دسترس است و نیز به دلیل اینکه ثبات ژنتیکی را بهتر از روش تکثیر از طریق اندام زایی حفظ می کند برای تکثیر تجارتی گیاهان سخت چوب ارجحیتدارد. برای رشد طولی ساقه جانبی، فراوانترین نوع ریزنمونه قطعات کوچک ساقه یا یک گره است. میزان تشکیل ساقه جانبی گاهی اوقات پس از چند واکشت افزایش می یابد سوزنی برگها معمولاً به طریق رشد ساقه جانبی تکثیر نمی شوند با این حال این روش برای Pinus caribaea  و P.oocarpa مؤثر بوده است. در نخلها اغلب جوانه های جانبی به تعداد کم وجود دارند. با این حال ایجاد جوانه جانبی در این ویترو ممکن است انجام شود. گاهی اوقات جوانه های جانبی جداشده از گیاهچه های این گونه بجای تشکیل جوانه های جانبی جدید، کالوسهای جنین زا تشکیل داده است.

 5-1-4-2 اندام زایی

در اندام زایی ساقه های نابجایی القاء می شوند که سپس ریشه دار می گردند. در این حالت به ندرت ریشه ها قبل از ساقه ایجاد می شوند. مثالی از مورد اخیر، تشکیل ساقه در ریشه های Malus punila است که توسطط Agrobacterium rhizogenes ایجادشد.

 در زمان تکثیر سخت چوبها به طریقه اندام زایی ساقه های نابجا اغلب مستقیماً روی ریز نمونه هایاندام های سبز یا روی بخشهای سبز متصل به ساقه های ریزازدیادی ایجاد شده است. این حالت، روی کالوس و اکشت شده کمتر متداول است. در سوزنی برگها تشکیل مستقیم جوانه نابجا روی  هیپوکوتیلها و  لپه های جنین ها و برگهای سوزنی جوان گیاهچه ها متداول است. زمانی که ریزنمونه های درختان مسن تر کشت شدند، تشکیل جوانه نابجا بیشتر روی کالوس اولیه یا واکشت شده ایجاد شد. برگ سوزنی انفرادی یا فلس اولیه گاهی اوقات به ساقه های نابجا تبدیل می شوند. گاهی ساقه های نابجا روی برگهای سوزنی ساقه های نابجا ظاهر شده است.

5-1-4-3 جنین زایی سوماتیکی

تا این اواخر جنینی زایی سوماتیکی فقط در تعداد کمی از گونه های درختی امکان پذیر بوده است. اما این روش به سرعت رایج می شود. جنین های سوماتیکی هم بطور مستقیم روی سطح ریز نمونه تشکیل می شوند و هم بطور غیرمستقیم؛ برای مثال در کالوسهای واکشت شده یا در توده های سلولی که شامل شبه جنین های کوچک یا سلولهای شبه آویز زیر کیسه جنینی[10] تشکیل می شوند. جنین زایی معمولاً در زمانی که یک تعداد کمی ژئوتیپ می خواهند به تعداد زیادی تکثیر شوند. بر تکثیر به روش تشکیل ساقه نابجا با اندام زایی ترجیح داده می شود، زیرا:1) جنین زایی تعداد افزونه بیشتری را در مقایسه با سایر روشهای تکثیر تولید می کند 2) در جنین زایی کار کمتری از سایر روشها نیاز است، زیرا ایجاد ریشه، بعنوان یک مرحله جداگانه نیاز است. 3) امید می رود بتوان از جنین های پوشش داده شده[11] به عنوان بذر  مصنوعی استفاده کرد بنابراین انتقال نمونه ها از کشت این ویترو به مزرعه به مقدار زیادی ساده می شود. تکثیر به دو روش تشکیل ساقه نابجا زمانی که تعدادی ژئوتیپ متفاوت به تعداد کم می خواهند تکثیر شوند، روشی مؤثر است.( گیاهان زینتی)

در تحقیقات جنین زایی سوماتیکی،  همانند مطالعه شروع شدن ساقه جانبی و نابجا، بیشتر تمرکز روی تغییر محیط کشت غذایی بوده است. البته تفاوت عمده ای بین تشکیل جنین و ساقه وجود دارد که غالباً به آن توجه کافی نمی شود جنین درحال رشد داخل بذر در محیطی رشد می کند که احتمالاً تبادل گازی محدودتر از میحطی است که ساقه های داخل جوانه در حال رشد در آن قرار دارند. بنابراین ترکیب گاز محیط جنین احتمالاً از آنچه نوک ساقه را احاطه می کند متفاوت است. در آزمایش با گندم که در معرض هوای حاوی فقط 9%  اکسیژن بودن جنین یافت شد کاهش سطح اکسیژن در هوای لوله کشت باعث تحریک جنین زایی سوماتیکی شد. احتمالاً ترکیب  گازی که  جنین داخل بذر در معرض آن قرار دارد هنگام با رشد جنین تغییر می کند؛ بنابراین در جاییکه به بلوغ رساندن مناسب جنین های سوماتیکی مشکل باشد تغییر ترکیب گازی ممکن است لازم باشد جنبه دیگری که احتمالاً باید به آن توجه شود فشار مکانیکی است فضای در دسترس برای توسعه یک جنین درحال رشد در داخل بذر محدود است. نیروی فشارهای بکاررفته دربافتهای رشد یافته در این ویترو بر تقسیم سلولی و به دنبال آن بر نظم ویژه فعالیتهای تقسیم سلولی اثر میگذارد نتیجه این کار میتواند رشد سازمان یافتة بافتهای سازمان نیافته باشد.

 5-1-4-4 گره ها

در کنار سه روش اصلی ریز ازدیادی که مطرح شد اخیراً روش دیگری به نام تولید گره های ریخت زا در کشتهای سوسپانسیونی ابداع شده است.( بخش 5-6 را ملاحظه کنید) تولید گره ها گزینه خوب دیگری برای جنین زایی است که برای تکثیر انبوه  خصوصاً در جایی که جنین زایی هنوز مشکل است بکار می رود. همانند جنین زایی، در این روش میزان تولید بالا و به حداقل کار نیاز است.

5-1-5 کارکرد کلونهای جوان و پایه های مادری بالغ در برنامه ای به نژادی درختان

بدلیل دورة طولانی زندگی درختان و بخاطر جثة بزرگشان، اکثراً به نژادی درختان بسیار کمتر از گیاهان زراعی مورد توجه بوده است. بنابراین در بیشتر گونه های درختی تنوع در ارقام وحشی همانند جمعیت های اصلاح شدة ژنتیکی نسبتاً بالاست. از این تنوع  بزرگ می توان در تکثیر کلونی گیاهان جوان همانند گیاهان بالغ بهره مند شد.

این شکل یک گونه سوزنی برگها را نشان میدهد و ارتفاع درخت را بعنوان نمونه ای از صفات مطلوب بکار می رود البته این شکل می تواند برای سایر درختان و دیگر صفات غیر از ارتفاع درخت نیز بکار می رود.

برای بیشتر گونه هایی که شایستگی آنها در آزمایش مزرعه ای اثبات شده ریزازدیادی در ختان امکانپذیر نیست. این درختان مسن تر از آن هستند که بطور مناسبی به این ویترو پاسخ دهند. بنابراین دستور کار زیر غالباً توصیه می شود. کلونهای ریزازدیاد شده از تمام تلاقیها تهیه می شود نیمی از هر کلون ریزازدیاد شده از طریق نگهداری در هوای سرد در مرحله جوانی حفظ می شود. در حالی که نیم دیگر در مزرعه آزمایش می شود. پس از آنکه آزمایش مزرعه ای مشخص کرد، کدام کلون بهترین است کلونهای جوان آنها را که در شرایط سرد نگهداری می شوند برداشته و ریزازدیادی می شوند. روش مشابه زمانی امکانپذیر است که کلونها از طریق ریشه دار  کردن قلمه ها انجام بگیرد. در آن مورد فشار اولیه از طریق هرس شدید در مرحله جوانی حفظ می شود.(پرچین ها)

روشهای فوق که ترکیبی از روشهای آمیزش، ریزازدیادی، آزمایش کلون و نگهداری کلونها در مرحلة جوانی از طریق نگهداری در هوای سرد می باشد روشی است که اولین بار برای Pinus rsdiata انجام شده بود. کشتهای Pinus radiata را می توان تحت شدت نور کم در دمای 4-5 درجه سانتیگراد برای حدود 5 سال نگهداری کرد. احتمالاً زمان نگهداری مشابهی برای سایر گونه ها نیز امکان پذیر باشد. برای صفاتی نظیر سرعت رشد، یک دوره 5 ساله آزمایش مزرعه ای از نظر مدت زمان کافی است. سایر صفات ممکن است به مدت زمان بیشتری برای آزمایش نیاز داشته باشند. اینکه آیا ممکن است بتوان با کمک انجماد با روش نیتروژن مایع این دورة 5 ساله را طولانی تر نمود هنوز مشخص نیست.

 5-2 القای اندام زایی و جنین زایی در مواد گیاهی جوان

5-2-1 القای ساقه

5-2-1-1 القای ساقه در جنین بالغ و ریزنمونه های حاصل از گیاهچه بازدانگان

ریزازدیادی سوزنی برگها برای اولین بار توسط سامر و همکاران در سال 1975 باکشت جنین های Pinus palutris انجام شد. آنها ساقه های نابجایی بدست آوردند که آنها را برش داده و متعاقباً ریشه دار کردند. از آن پس بسیاری از گونه های سوزنی برگها از جنین با قطعات جنین، بویژه از لپه ها ریزازدیادی شدند. برای برخی گونه ها، بویژه Pinus radiata این روش مؤثر بود، اما برای بقیه چنین ریزازدیادی مؤثرتر از ریشه زایی سنتی قلمه ها نبوده است. این موضوع بخصوص در جنس Abies با مشکل همراه بوده است. تعداد افزونه در هر ریز نمونه غالباً کم است و به دلیل عملیات زیادی که لازم دارد هزینه های نیروی انسانی بالاست.

 معمولاً جنین های جداشده از بذرهای خیس خورده ضدعفونی سطحی شده یا استریفیکاسیون شده بر بذرهای خشک ارجحیت دارد. ریز نمونه های جنینی از بذرهای خیس خورده به راحتی جدا شده و گاهی اوقات واکنش بهتری به این ویترو نشان میدهند. جنین های جداشده از بذرهای استریفیکاسیون شده Chamaecyparis nootkatensis تعداد ساقه بیشتری از آنها که از بذرهای خشک شده جدا شدند تشکیل دادند. سرمادهی به مدت 8  هفته به تشکیل ساقة نابجا روی کوتیلدونها منجر شد. یک دوره سرمادهی 4 هفته ای بیشتر، بخوبی باعث تشکیل ساقه روی هیپوکوتیل گردید. جوانه زنی جنین های Pinus canariensis حاصل از بذر خیس شده در زیر شیر آب( آب لوله کشی) نسبت به بذرهای خیس شده در بشر دارای کیفیت بهتری بودند.

 گاهی اوقات جنین کامل بعنوان ریزنمونه بکار می رود.( شکل 5-2-1-1 الف) اما در اکثر موارد ریشه حذف می شود. عدم توانای در حذف ریشه غالباً باعث می شود جوانه زنی جنین و به دنبال آن رشد گیاهچه بجای رشد نابجا انجام بگیرد. گاهی اوقات نتابج بهتر زمانی بدست آمده که جنین به همراه کوتیلدونها بصورت وارونه روی سطح محیط کشت قرار گرفته است. محتمل ترین توضیح برای این حالت این است که کوتیلدونها اندامهای طبیعی جذب غذا هستند و اینکه توزیع تنظیم کننده های رشد در بافتها توسط وارونه قرارگرفتن جنین تحت تأثیر قرار می گیرد. کوتیلدونها مکرراً از  جنینهای در حال جوانه زنی حذف شده و به عنوان ریزنمونه جدا به کار می رود. چنین موردی در آزمایشهای Prinus radiata و Pinus ponderosa انجام گرفته است.

 مزیت این عمل در این است که از هر جنین در حدود شش ریز نمونه که همه آنها دارای ژئوتیپ مشابه هستند بدست می آید. این کار به کاهش تنوع آزمایش کمک می کند. قابلیت ریخت زایی کوتیلدونها به سن آنها بستگی دارد. ظرفیت تشکیل اندام هوای از کوتیلدونها Pinus canariensis در آنهایی که سه روز پس از جوانه زنی جدا شدند از همه بیشتر بود.

 نیازهای غذایی از گونه ای به گونه دیگر به مقدار زیادی تغییر می کند. برای Pinus elliottii و P.strobus غلظت نیتروژن محیط کشت MS بسیاز زیاد بود. برای چنین گونه هایی از محیط کشت MS رقیق شده و یا محیط های دیگری که مقدار نیتروژن آنها کمتر باشد استفاده می شود. ریزنمونه های کوتیلدونی Pinus ponderson روی محیط کشت(GD )[12] ساقه نابجای بیشتری از5 محیط کشت دیگری که عموماً برای سوزنی برگها استفاده می شود تشکیل دادند. کوتیلدونها روی میحط های کشتی که دارای کمترین غلظت نمک و آمونیوم بودند بهترین تظاهر را داشتند.

طی مرحله القای ساقه، اکسین و سیتوکینین موردنیاز است. سیتوکینین در اکثر موارد پس از این مرحله حذف می شود. BA معمولاً مؤثرتر از  یا دیگر سیتوکینینها است. ترکیب سیتوکینینهای مختلف گاهی اوقات بر استفاده به تنهایی از BA ارجحیت داد. در کشت Picea rubens ترکیب BA و کینتین به همان میزان که BA به تنهایی بکار می رفت. ساقه نابجا تشکیل شد البته ساقه های تشکیل شده در ترکیب BA – کینتین دارای کیفیت بهتری بودند.

 سیتوکینینها در صورتیکه در غلظت بالا برای یک دوره کوتاه زمانی بکار می رود غالباً از غلظت کم برای دورة طولانی زمانی بکار می رود  غالباً موثر  از غلظت کم برای دوره طولانی تر هستند. در کشت Picea abies یک تیمار دو ساعته با 250 میکرومول BA مؤثرتر از کشت به مدت 4 هفته در محیط کشت حاوی 5 میکرومول BA بود معمولاً کاربرد BA در غلظت های پایین تر از غظت های مطلوب برای ایجاد ساقه قابل توصیه است. غلظت های مطلوب اغلب سبب نمو ضعیف ساقه یا شیشه ای شدن آنها می شود.

 ریزازدیادی Peeudostuga menziesii از طریق القای ساقه نابجا نیاز به BA در غلظتی بیش از ریزازدیادی از طریق رشد طولی ساقه جانبی دارد.

 گاهی اوقات بازدارنده های رشد همانند تحریک کننده های رشد در القای ساقه مؤثرند. برای مثال مشاهده شده است که در معرض قراردادن بازدارنده ABA به مدت 3 تا 4 هفته، باززایی ساقه از کشت کوتیلدون Pinus taeda را تحریک می کند.

 کوتیدولنهای سوزنی برگ ها می توانند ساختارهای نابجای متفاوتی غیر از ساقه، بعنوان مثال جوانه های کاذب [13] توسعه یافته ناقص، جوانه های بسته و برجستگی های شبیه برگ تولید کنند. اینها اغلب توانایی تشکیل ساقه های مناسب را ندارند و بنابراین دارای ارزش عملی کمتری هستند. 

اکثراً القای ساقه مستقیم است بعبارت دیگر ساقه ها از بافتهای ریزنمونه ایجاد می شوند. القای غیرمستقیم ساقه از کالوس واکشت شده کمتر متداول است. سیستمی برای تولید پیوسته نابجا برای Pinus radiata ارائه شده که در آن محیط کشت از طریق غوطه ور شدن کشتها برای دوره های کوتاه در فواصل منظم در محیط کشت مایع تجدید می گردد. میزان تشکیل ساقه های جانبی در کشت Pinus carbaea، P.tecunumanii و P.oocarpa از طریق طول منشاء ریزنمونه ساقه تعیین شد. این ریزنمونه از ساقه های ریزازدیادی که به مدت 6 هفته در این ویترو رشد طولی داشتند گرفته شده بود. قطعات ساقه 15 یا 20 میلیمتر طول و قطعاتی که از نزدیکترین مکن به نوک ساقه هستند سودمندتر از قطعات کوچکتر یا نزدیک به انتهای ساقه بوده اند.

 حذف جوانه انتهایی ساقه های ریزازدیاد شده Pinus canariensis تشکیل ساقه های جانبی را تحریک کرد. ساقه های جانبی گاهی اوقات در شرایط این ویترو از ساقه های نابجا تظاهر بهتری دارند. ساقه های نابجای Picea abies به نحو کندتری رشد کردند و بخوبی ساقه های جانبی ریشه نداشتند.

 استفاده از گیاهچه ها گاهی اوقات برای ریزازدیاد مشکل تر از جنینهاست. با این حال هنوز ریزازدیادی سوزنی برگهای متعددی توانسته بدون مشکل زیادی از ریز نمونه های حاصل از گیاهچه های 2-3 ساله انجام شود. تعداد کمی گیاه سوزنی برگ توانسته اند از درختانی که عمری در حدود 10 سال دارند با سهولت نسبی تکثیر شوند.

انواع مختلف زیرنمونه برای ریز ازدیادی گیاهچه بکار رفته است این ریزنمونه ها عبارت بوده است از: برگ های سوزنی که درست پس از متورم شدن جدا شده اند، مریستم های در حال استراحت انتهایی یا جانبی، جوانه های فاسیکولار[14] وساقه های در حال طویل شدن.

 برای القای ساقه های نابجا از ریز نمونه های گیاهچه ، روش کار به مقدار زیادی مشابه ایجاد ساقه از جنین با قطعات جنین است. سیتوکینین، معمولاً BA یکی از عناصر کلیدی در این فرآیند است زمانی که گیاهچه استفاده می شود می توان BA را قبل یا پس از جداسازی از ریزنمونه بکار برد.

محلول پاشی با BA روی شاخ و برگ گیاهچه های Picea abies و Pinus sylvertris قبل از جداسازی به اندازه ای که ریزنمونه باBA تیمار شود یا BA در محیط کشت بکار رود مؤثر بود. محلول پاشی گیاهچه های Pinus oocarpa منجر به تعداد زیادی از جوانه های اینترفاسیکولار شد که  جداشده ودر این ویترو ریشه دار شدند. مزیت این روش این است که تکثیر ساقه قبل از کشت این ویترو انجام شد و از هزینه های آزمایشگاهی مربوطه در آینده جلوگیری می شود. محلول پاشی گیاهچه ها با BA قبل از جداکردن ریزنمونه در Pinus mugo نیز به شرطی که گیاهچه های محلول پاشی شده به مدت 10 هفته در دمای 4 سانتیگراد نگهداری شوند، مؤثر بوده است. گاهی اوقات ایجاد زخم در القای ساقه نابجا مؤثر است. این مورد در زیر نمونه های هیپوکوتیل حاصل از گیاهچه های جوان Larix decidua صادق است.زمانی که نوک های ساقه با یک برگ سوزنی اولیه متصل به آن از گیاهچه های Sequoiadendorn gigarteum جدا و کشت شد اندام زایی بدون کاربرد تنظیم کننده های رشد آغاز شد.

 5-2-1-2 ایجاد ساقه در جنین بالغ و ریزنمونه های گیاهچه ای نهان دانگان

رایجترین ریزنمونه ای گیاهچه ای استفاده شده عبارتند از: جوانه، نوک ساقه یا قطعات جوانه دار ساقه. ساقه های نابجا یا جانبی برروی این ریزنمونه ها با در واکشت تشکیل می شوند. برای اکثر گونه ها ریزنمونه ای که بهترین واکنش را نشان میدهد. جوانه است که درست در فصل بهار شروع به رشد کرده باشد. جوانه هایی که به زمان خواب نزدیک می شوندغالباً کمتر مطلوب هستند ریز نمونه هایی که از گیاهچه های با رشدطولی سریع گرفته شده کمترین و در آنهایی که از گیاهچه های بدون رشد  طولی گرفته شده بود بیشترین بود و برگها توسعه کاملی یافتند. اثرات مکانی نیز بایستی مدنظر قرار بگیرند.

 ریز نمونه های گرده دار که از گیاهان Morus abla 3 تا 4  ساله جمع آوری شده بودند.ساقه های جانبی بلندتر با ریشه های بهتری نسبت به آنهایی که از سایر مکانهای گیاه جمع آوری شده بودند تولید کردند.

 ساقه ها در این ویترو غالباً در اوایل دوره هایی از سکون / تورم( فعالیت) را پشت سر می گذارند. پس از تعدادی واکشت رشد ساقه تدریجاً ثابت شده و تشکیل ساقه و رشد ادامه می یابد. در این مرحله کشتها به مرحله تولید وارد شده و برای ریشه زایی، سازگاری و بهره تجاری مطلوب می گردند. کشتهای حاصل از گیاهچه های جوان برای تثبیت، ساده تر از آنهایی هستند که از ریزنمونه های مسن تر گرفته شده اند. تثبیت کشتهای برخی از جنسها مشکل است. تثبیت تدریجی نیز برای جنس Juguns گزارش شده است. در درختانی که بطور طبیعی از رشد کاملاً کندی برخوردارند می توان انتظار داشت که ریزازدیادی آنها مشکل باشد.

 ریزازدیادی برخی گونه ها بدلیل کالوس زایی زیاد حتی پس از کشتهایی که تثبیت شده اند مشکل است.گاهی اوقات می توان با آن از راه کاهش میزان سیتوکینین در محیط کشت به مقادیری پایین تر از مقدار مطلوب برای آغاز ساقه، مقابله نمود.

بیشتر گونه های درختی نهان دانگان روی محیط کشت تغییر یافته MS یا WPM باترکیبات متفاوت سیتوکینین عمدتاً BA واکسینها کشت می شوند. برای بسیاری

ازگونه های سخت چوب غلظت مطلوب BA برای القای ساقه بین  و مول است. تشکیل ساقه نیز غالباً از طریق اکسین در غلظت های پایین تحریک می شود.

تکثیر تعدادی از گونه ها، از طریق کالوسهای واکشت شده انجام شده است. البته این کار می تواند به بی ثباتی ژنتیکی منجر شود. برخی اکسینها به ویژه انواع وابسته به 2,4-D محرک قوی تشکیل کالوس هستند و بنابراین بایستی از آنها پرهیز نموده یا فقط در غلظتهای بسیار کم برای القای ساقه استفاده نمود.

5-2-2 جنین زایی

در اکثر موارد، جنین زایی در جنینهای جدا شدة بالغ یا نابالغ یا در ریزنمونه های گیاهچه ای خیلی جوان آغاز می شود. تعداد گونه هایی که برای آنها جنین زایی در ریزنمونه های درختان بالغ انجام شده است هنوز بسیار محدود است. در حالت معمولی، القای جنین زایی در مواد گیاهی جوانتر ساده تر است. ویلیامز و ماشواران(1986) تصریح کردند در جنین جوان، سلولهای بسیاری وجود دارند تا مرحلة نمو جنینی را طی نمایند. همان طوری که جنینها بالغ شده و جوانه می زنند، تعداد سلولهایی که می توانند تشکیل جنین دهند کاهش می یابند. در نتیجه ظرفیت تشکیل جنین های غیرجنسی کاهش می یابد. البته معایبی در به کارگیری جنینهای سلول تخم نابالغ جهت تکثیر کلونی وجود دارد. جنینهای نابالغ فقط در فصل خاصی در دسترس هستند. همچنین جداسازی و کشت آنها به دلیل اندازة کوچکشان بسیار مشکل است؛ بنابراین معمولاً جنینهای نابالغ فقط زمانی به کار می روند که مواد مسن تر واکنش نشان نمی دهند.

5-2-2-1 جنین زایی در ریزنمونه های جنین نابالغ بازدانگان

جنین زایی سوماتیکی در بازدانگان پدیده ای جدید است. کشت جنینهای نابالغ Picea abies برای اولین بار توسط هاکمن و همکاران، 1985 انجام گرفت و بلافاصله پس از آن برای سایر گونه های سوزنی برگها گزارش شده. جنین زایی سوماتیکی به دلیل توانایی آن به تولید تعداد زیادی نمونة ارزان اهمیت دارد، به علاوه انتظار می رود که این نمونه ها نسبت به نمونه های تولیده شده به روش اندام زایی در آزمایشهای مزرعه ای بی نظمی کمتری نشان دهند.

موفقیت اولیه هاکمن و همکاران در نتیجه انتخاب جنینهای نابالغ بعنوان ریز نمونه، کاربرد در محیط کشت اولیه ، جداسازی و واکشت توده بافتی سفید ترد نیمه شفافی بود که روی ریزنمونه ظاهر شد. این توده بافتی سفیدژله مانند در کشت جنینهای بالغ تشکیل نمی شد. اینها کالوس سبزی را تولید می کردند که در عوض ساقه های نابجا تشکیل دادند. مشاهدات مشابهی بعداً برای ریزنمونه های جنینی سایر گونه های سوزنی برگها گزارش شد. توده های سلولی سفید ژله مانند که جنی سوماتیکی را تشکیل می دهند. معمولاً کالوس های جنین زا[15] خوانده می شوند. البته اصطلاح کالوس به دلیل اینکه بافتها، ترکیبی از تعداد زیادی جنین و آویز[16] است مناسب نیست. به این جنین ها اغلب به اشتباه پیش جنین[17] گفته می شود. چامبرلین اصطلاح پیش جنینی را محدود به مرحله ای از نمو می داند که اسپروفیت از قسمت انتهایی تخم ظاهر می شود. معادل مرحله پیش جنینی تخمی هنوز در کشتهای جنین زایی یافت نشده است. توده های سلولی جنین زا را می توان بارنگ آمیزی توسط است وکارمن از نوع غیرجنین زا تشخیص داد از نشانگرهای شیمیایی نیز استفاده شده است. 5-2-2-2 جنین زایی در ریزنمونه های جنین بالغ و گیاهچه های جوان بازدانگان

  مزایای بکارگیری جنینهای بالغ سوزنی برگها بعنوان ریزنمونه بجای نوع نابالغ به صورت زیر است: 1) خارج کردن بذرها از مخروطهای نارس مشکل تر از مخروط های بالغ است 2) برای بیشتر سوزنی برگها، جنینهای بذر های بالغ در زمان نگهداری قابلیت زنده ماندن طولانی تری از جنین های بذرهای نارس دارند. در نتیجه جنینهای بالغ مناسب معمولاً در طول سال دردسترس هستند. در حالی که جنین های نابالغ فقط بصورت فعلی قابل استفاده هستند. مشکل اصلی جنینهای بذرهای رسیده این است که شروع جنین زایی در اینها  غالباً مشکل تر از جنین های نابالغ است. در ریزنمونه های جنین بالغ ژئوتیپ اغلب دارای اثر مشخصی در جنین زایی است در این مورد برخی بذرها واکنش بسیار بهتری از دیگران نشان می دهند.

برای برخی گونه های نگهداری طولانی مدت بذر مشکل بوجود می آورد. نگهداری  بذرهای Seqouia seppervirensبرای مدتی بیش از چند ماه در 4 درجه سانتیگراد به کاهش القای جنین زایی انجامیده است. از طرف دیگر در تحقیقی با Picea glauca جنین زایی در ریز نمونه های جنینی حاصل از بذرهایی که جنین زا بودند با چگونگی جوانه زنی بذر همبستگی داشت. همچنین مقدار جنین زایی به مدت زمانی که بذرهای P.glacua قبل از برش ریز نمونه آب جذب می کردند بستگی داشت و جذدب 4 ساعت آب زمان مناسبی بود.

تولید مداوم جنینهای سوماتیکی را میتوان از طریق القای مکرر انجام داد. برای Picea abies سیستمی توسعه یافت که در آن ابتدا توده سلولی جنین زا از جنینهای تخمی بالغ و سپس از دوره های متوالی جنینهای سوماتیکی در  حال بلوغ بوجود می آمدند.  جنینهای سوماتیکی،کشتهای جنین زا را با سرتتی 2 برابر جنینهای تخمی آغاز کردند و میزان DNA هسته در این دوره ها ثابت باقی ماند.

برای جنین زایی در جنینهای بالغ نیازها مشابه جنین زایی در جنینهای نابالغ می باشد. یکی از عوامل محر ک اصلی در هردو یا اکسینهای وابسته می باشد. فقط در برخی موارد ، با اکسینهای غیر از توده های سلولی جنین زا شروع شده است. در مطالعه دیگری با Picea abies نیز مؤثر بوده است. افزودن مول بوتیوتین سولفور کسیمین [18] یک بازدارنده سنتز گلوتاتیون نمو جنین های سوماتیکی را سه برابر افزایش داد. در مطالعه دیگری با جنین های بالغ Picea abies میزان بالایی از جنین زایی در محیط کتشی با غلظت کم بدست آمد که در آن نیترات آمونیوم توسط گلوتامین جایگزین شده بود با بکارگیری محیط کشتی با غلظت کم از تکثیر گسترده کالوس سبز غیر جنین زا جلوگیری شد.

5-2-2-3 جنین زایی در ریزنمونه های جنینی نابالغ نهان دانگان

جنین زایی در کشتهای درختان نهان دانه عموماً با جنین های یا حتی ریزنمونه های بالغ تر، انجام می شود علی رغم این مثالهایی از کابرد جنین های نابالغ وجود دارد. در مورد Awsculus  hippocatanum جنین های نابالغ را بر بالغ ترجیح میدهند. زیرا جنین های نابالغ حاوی مواد بازدارنده کمتری هستند. در این آزمایش پرولین برای القای جنین لازم بود در حالی که گلوتامین و GA برای جوانه زنی مناسب جنینهای سوماتیکی مورد نیاز بود در کشت های Liriodendon tulipifrea جنین سوماتیکی در کالوسهای شکننده گره ای حاصل از جنین های نابالغ روی محیط کشت جامد با ، BA و کازئین هیدرولیزشده انجام شد جنین های بالغ، جنین های سوماتیکی تشکیل ندادند.به همین صورت کوتیلدونهای جنینهای نابالغ تخمی Juglans regia ساده تر از جنین های بالغ تشکیل  جنین سوماتیکی دادند. و همچنین جنین زایی در جنینهای Magnolia virginiana که دو هفته پس از گرده افشانی جداشده بود ساده تر از جنین های مسن تر بود. در جنین های که دو هفته پس از گرده افشانی جدا شدند توده بافتی پیش جنینی با تکثیر سریع تشکیل شده در  حالی که در جنینهای مسن تر جنین زایی مستقیماً روی زیرنمونه انجام شد. علف کشی وابسته به  برای برانگیختن جنین زایی سوماتیکی در جنینهای نابالغ Persea Americana استفاده شده است. درQuercut rubra جنینهای حاوی کوتیلدون اولیه و کوتیلدونهای قبلی شکل بیشترین تعداد جنین سوماتیکی را تولید کردند. در صورتی که اینها روی کشت بدون تنظیم کننده رشد کشت می شدند قطبیت نرمال توسعه می یافت و در صورتی که در معرض تیمارهای آب گیری و خشک شدن قرار می گرفتند بطور مناسبی جوانه می زدند. سن جنین نیز در انگیزش کشتهای جنین زایی Cocos nucifera مهم بود. جنین های 6-7 ماهه پس از گرده افشانی دارای بیشترین بازده بود در حالی که جنین های حاصل از تخمهای مسن تر بدون اینکه توده های سلولی جنین زا تشکیل شود در کشت جوانه زدند. جنین های نابالغ Carya illinonsis جمع آوری شده در زمانی که کوتیلدونهای درحال توسعه سریع بوده به مقدار بیشتری از  جمع آوری در سایر مراحل نمو، جنین سوماتیکی تولید کردند. ریز نمونه ها به مدت چندهفته روی محیطی همراه با   و BA کازئین هیدرولیزدشده کشت شدند و سپس به محیط بدون هورمون منتقل گردیدند. ژئوتیپ بر میزان انگیزش جنین در یک رقم مؤثر بود اما در دیگران اینطور نبود.

5-2-2-4 جنین زایی درجنین بالغ و ریزنمونه های حاصل از گیاهچه های جوان نهان دانگان

در حالی که جنین زایی سوماتیکی در سوزنی برگها فقط به تازگی به کار رفته است این روش در ریزنمونه های جننی بالغ و گیاهچه های تعدادی از گیاهان چوب سخت و نخلها به مدت چند دهه متداول بوده است.

 همانند جنین زایی در سوزنی برگها  و گلوتامین اغلب برای شروع جنین زایی در ریز نمونه ها نهاندانگان لازم است. نوع هیدرات کربن و غلظت در طی مراحل مختلف نموی جنین زایی نقش دارد و همانند سوزنی برگها، ABA گاهی اوقات برا ی نمو جننینی و جوانه زنی لازم است. در آزمایشی با غلظت ها و ترکیبات  مختلف  نفتوکسی استیک اسید (NOA) و BA در محیط کشت، ریز نمونه های جنینی Vitis longii  و V.vinifera روی NOA جنینهای سوماتیکی بیشتری از

 تولید کردند. غلظت مطلوب NOA برای انگیزش جنین زایی یک میلی گکرم در لیتر و برای BA بین 2/0 و 1 میلیگرم در لیتر بود. پیکلورام یک اکسین قوی دیگر  در القای جنین زایی منشأ گرفته بود. پیکلورام برای کشتهای تاریکی ابتدا برای سه ماه در غلظت بالا و سه ماه در غلظت پایین بکار رفت. در این حالت کالوس اولیه غیرجنین زا تولید گردید که پس از انتقال به محیط کشت بدون هورمون و نور کالوس ثانویه جنین زا تشکیل شد.

 اکسینهای قوی نظیر  با ترکیبات وابسته همیشه برای جنین زای ضروری نیستند. در کشتهای هیپوکوتیل گیاهچه های چهارهفته ای IAA, Santalum album در غلظت پایین جنین زایی را تحریک کرد، در حالی که  مانع این کار شد. عصاره مخمر ، کازئین هیدرولیزشده و اسیدهای آمینه محرک تمایز بعد جنینهای سوماتیکی بودند البتهمانع این کار شد. عصاره مخمر کازئین هیدرولیزشده و اسیدهای آمینه محرک تمایز بعدی جنین های سوماتیکی بودند. البته

 در 1650  میلی گرم در لیتر مطلوب بود. جنین زایی عموماً بطور مستقیم روی ریزنمونه، بافت های سازمان یافته یا روی کالوس در واکشت اتفاق می افتد. البته جنین زایی در کشتهای تعلیقی بدلیل اینکه می تواند جنین سوماتیکی را در بالاتریت مقدار تولید و کمترین حد دستکاری تهیه کند ترجیح داده می شود. متأسفانه جنین زایی از سلولها در کشت های تعلیقی در درختان هنوز کم است. منشأ برخی از جنین نهای سوماتیکی از یک سلول منفرد و برخی دیگر از چندین سلول است. بعضی بدنبال روشی هستند که مشابه روش جنینهای تخمی است اما دیگران به دنبال راهی هستند که اساساً متفاوت است. رشد یا جوانه زنی غیرطبیعی متداول است. گاهی اوقات در جه غیر طبیعی بودن می تواند از طریق تهیة محیط کشت متفاوت در طی هر مرحله رشدی عمده جنین های سوماتیکی کاهش یابد.

 5-3- انگیزش اندام زایی و جنین زایی در مواد گیاهی بالغ

5-3-1 اهداف ریزازدیادی مواد گیاهی بالغ

ریزازدیادی درختان بالغ معمولاً از تکثیر این ویتروی اندامهای مشابه جوان آن سخت تر است با وجود این درختان بالغ بدلیل ینکه به مدت کافی در مزرعه بودها ند و ارزش برتر آنها ثابت شده است ترجیح داده می شوند.

همانطو رکه پیشتر اشاره شد نکته مهم در کلون کردن درختان بالغ بدست آوردن ترکیبات ژنی عمدتاً غیرافزایشی است که صفات برتر و آنهایی را که در نو  ترکیبی جنسی عمدتاً از دست می روند می توان دوباره جمع آوری کرد. گاهی اوقات علاوه بر این هدف دلایلی، برای تمایل به کلون کرند درختان بالغ وجود دارد. برخی گونه ها شامل بعضی ازگیاهان زراعی عمده ماده  یا نر عقیم هستند یا ممکن است بذرهایی را تشکیل دهند که دارای مشکل جوانه زنی باشند. چنین  گیاهانی تنها میتوانند از طریق   کلون تکثر شوند. در برخی مورد نیاز به کلون کردن به دلیل اینکه گونه ها تهدید به انقراض میشوند تشدید می گردد. این موضوع در خصوص Leucopogon obtectus و Hyophorbe amariculis که به یک تک درخت در مورتیس کاهش یافته بود صادق است. گرچه باور کرده بودند تولیدکننده بذرهای ضعیفی بودند و بنابراین نامزدکلون شدن انبوه می باشند. در برخی گونه های دولپه ای فقط درختان ماده ارزش اقتصادی دارند تکثیر چنین گونه های از طریق بذر نه تنها درختان ماده مطلوب بلکه در ختان نر مطلوب را نیز تولید می کنند. این درختان بعنوان جنس نر تا زمانی که به بلوغ جنسی برسند ممکن است قابل شناسایی نباشند. در نتیجه نمی توان آنها را پیش کار کاشت حذف نمود. بنابراین این گونه هایPhoenix dactilifera, Carica cardamarcensis و Simmondsia chinensis ترجیحاً از طریق کلون سازی ماده های بالغ از نظر جنسی تکثیر میشوند.

5-3-2 ریزازدیادی گونه هایی که به آسانی تکثیر می شوند   

در برخی گونه ها درختان بالغ با سهولت نسبی میتوانند رزازدیادی شوند. البته حتی در این موارد موفقیت ریزازدیادی به عواملی چون بنیه والد، تاریخ جمع آوری و غیره بستگی دارد. بعنوان مثال جوانه های Populus tremua که در ماه جمع آوری می شوند بیشتر از آنهایی که در ژانویه یا اکتبر جمع آوری شدند در شرایط این ویترو ساقه تشکیل دادند.

در درختان بالغ برخی گونه های القای جنین زایی سوماتیکی در کشتهای حاصل از ریزنمونه ها امکان پذیر است. جنین زایی در کشتهای کالوس ریر نمونه های حاصل از برگ Sapindus trifoliatus و کشت تعلیقی محلول حاصلاز کشتهای ساقه Populus و در کشتهای تعلیقی Sntalum album انجام شده است.

5-3-3 ریزازدیادی گونه های سرسخت[19]

5-3-3-1 انتخاب ریزنمونه

مهمترین جنبه ریزازدیادی درختان بالغ سرسخت انتخاب ریزنمونه است. دربسیار از موارد فقط تعداد اندکی از بافتها واکنش مطلوب نشان می دهند. همین که نوع ریزنمونه با بالاترین قابلیت ریخت زایی شناسایی گردید آزمایش بعدی را می توان برای بهینه سازی عکس العمل آغاز کرد.

 بافتها در برخی قسمتهای درختان بالغ باسرعت کمتری از دیگر قسمت های بالغ می شوند. بعلاوه برخی بافتها و مریسمتها که انعطاف پذیری ظاهری بالایی نشان می دهند دوره های ویژه ای در چرخه رشد سالانه آنها وجود دارد.  موردی را که برای ریزازدیادی درختان توصیه می شود بهره گیری از این پدیده است. بطور خلاصه جداکردن بافت مناسب در زمان مناسب برای استفاده بعنوان ریز نمونه مهم است.

 بهترین نمونه برای بلوغ دیررس در بافتهای درختی شاخه ای تنه جوش [20] است این شاخه ها معمولاً از جوانه هایی که در پوست ساقه گیاهچه های رشد یافته و در حالت خواب بوده نمو می یابد. در بسیاری از گونه های سخت چوب، شاخه های تنه جوش جوان هستند و بدین ترتیب به آسانی ریشه میدهند. البته استثناهایی وجود دارد. بعنوان مثال قلمه های شاخه های تنه جوش Liquidambar به سختی ریشه میدهند.

 متأسفانه شاخه های تنه جوش و اپیکورمیک جوان فقط در تعداد محدودی از گونه های سوزنی برگها موجود هستند.

 ریزازدیادی در گونه های سخت از ریزنمونه های حاصل از شاخه های تنه جوش بالغ  استفاده شده است. از پاجوشها نیز در ریزازدیادی درختان تک لپه ای استفاده شده است. برای اجتناب از محدودشدن انجام کشتها به چند ماهی که شاخه های جوان در دسترس هستند در C.crenata × Castancea sativa آنها را به مدت سه ماه قبا ز انجام ریزازدیادی در سرما نگهداری کردند. بهترین نتایج از ساقه هایی بدست آمده است که در زمستان جمع آوری، درسرما نگهداری شده و بعد جهت متورم شدن  جوانه ها در گلخانه یا اتاقک رشد قرار داده شد. در Castancea sativa ریزنمونه های گرفتهشده ا شاخه های جوان( رویش های نو) بیش از ریزنمونه های بدست آمده از تاج درخت در تکثیر ساقه مؤثر بوده است. بعلاوه در ساقه های حاصل از این ریزنمونه ها رشد طولی ساقه بهتر و زمان ریشه زایی بیشتری از ساقه های باززایی شده از ریزنمونه های حاصل از تاج درخت از خود نشان دادند. در گل ریز نمونه های حاصل از شاخه های تنه جوش بخوبی ریزنمونه های حاصل ازگیاهچه هستند. از سوزنی برگها فقط Cunninghamia lanceolata استفاده از این تنه جوش ها ریزازدیادی شده است. ریشه ها اغلب جوانتر از قسمت های دیگر درخت تصور می شوند. بعلاوه در برخی درختان وجود یک شیب جوانی در ریشه ها آشکار است. جوانترین قسمت نزدیکترین قسمت به تنه است. شاخه هایی که بطور طبیعی از ریشه های درختان می رویند معمولاً جوان هستند.

 5-3-3-2 پیش تیمار جوان سازی

پیوندزنی متوالی [21] قطعات درختان بالغ روی پایه های جوان اغلب به تظاهر مجدد خصوصیات جوانی منجر می شوند. گاهی اوقات مواد گیاهی پیوندی فوق، ریزنمونه هایی بوجود می آورند که دارای توانایی بهبود یافته ای برای القای سایه یا باززایی گیاهچه می باشند. همچنین با بکارگیری ریزنمونه ها از قلمه هایی که بطور متوالی ریشه دار شده بودند، رشد خوبی بدست آمد.

 علاوه بر پیوندزدن یا ریش دارکردن قلمه ها،پیش تیمارهای دیگری برای بهبود ریزازدیادی وجود دارد. ریزازدیادی Pinus pinaster از طریق گرفتن ریزنمونه از قلمه های ریشه داری که هرس،کوددهی و با BA  مه پاشید شده بودند بهبود یافت. همچننین مه پاشی درختان والد با BA ریزازدیادی pinus taeda را بهبود بخشید. پیش تیمار Carica papaya در ارتباط با حذف مخروط از درختان بالغ جهت تحریک رشد شاخه های جانبی بوده که بریده و ریشه دار شدند. نوک 1-2 سانتی متری این گیاهان حذف و سطح برش خورده بقایای ساقه جهت تولید شاخه های جانبی با BA در لانولین تیمار گردید. جوانه های جانبی کوچک از انیها جدا شده و ریزازدیادی گردیدند. این روش علاوه بر اینکه میزان ریزازدیادی را افزایش داد ریز نمونه های آلوده کمتری را هم تولید کرد. هرس قلمه های ریشه دار گلخانه ای Qyercus robur بالغ به ساقه های جدید منجر شد که کمتر از آنهایی که هرس نشده بودند چوبی شدند. ریزنمونه های گرفته شده از این ساقه ها بازشدن جوانه و رشد در این ویترو بهتری را نشان دادند.انگیزش ساقه در ریزنمونه قطعات شاخه C.crenata × Castancea 30ساله از طریق حذف این شاخه ها بهبود یافت.

 5-3-3-3 جوان سازی در این ویترو  

درجه ای از جوان سازی، همانگونه که اشاره شد با بهبود قابلیت کشتها برای تشکیل گیاهچه ها می تواند گاهی اوقات از طریق روشهای این ویترو بدست آید.  جوانسازی از طریق واکشتهای متوالی متداولترین آنهاست. این روش منجر به جوان سازی در سوزنی برگها همانند سخت چوبها شد. پس از واکشت های مختلف در کشت های

 Sequoia sempervirens باعث بهبود وضعیت ظاهری شد. واکشتهای زنجیره ای ریخت زایی ساقه های ریزازدیادی شدهvisit vinifera را از نوع بلوغ به جوانی تغییر داد.

 میزان تکثیر و ریشه زایی ساقه در کشت های Castanea sativa پس از 6 تا 12 واکشت بهتر شد.

 افزایش فراوانی واکشت می تواند دارای یک اثر باشد. در کشتهای حاصل از Sequoia sempervirens 500  ساله، شیشه ای شدنی که به علت سیتوکنین، در محیط کشت بود در ساقه های جانبی که به دفعات واکشت شدند بیشتر از آنهایی بود که کمتر واکشت شدند. البته، کیفیت این ساقه های جانبی زمانی بطور پیوسته بهبود یافت که بصورت منظم روی محیط کشت بدون تنظیم کننده رشد واکشت شدند. سرزنی ساقه ها به افزایش تشکیل جوانة نابجا روی برگهای سوزنی باقیمانده بر تنه ساقه ها منجر گردید. گیاهچه های حاصل از این جوانه های نابجا دارای رویش عمودی بودند در حالی که گیاهچه های حاصل از سایر روشها افقی گرا بودند.

 روش دیگر، ریزپیوندی رأس ساقة درختان بالغ روی گیاهچه های استریل در این ویترو است. ریزپیوندی انفرادی یا زنجیره ای در ترکیب با دیگر روشهای این ویترو به ریزازدیادی تعدادی از درختان سوزنی برگ بالغ و جوان انجامید. مریستمهای درختان Pinus pinaster 10 تا 100ساله که روی گیاهچه ها ریزپیوندی شدند در لوله آزمایش برروی گویهای سوبارود جوانه زدند. در این آزمایش پیوندک در حفره کوچکی قرار گرفت که از کندن قطعه بافت کوچکی از کنار اپیکوتی درست در بالای کوتیلدون ایجاد شده بود. ترشحات گیاهچه بعنوان چسبی برای حفاظت پیوند عمل کرد که بطور  ثابت در موقعیت مناسب قرار گیرد. ریزپیوندی مشابه مینیاتوری کردن نیازمند ابزار ویژه ای برای جداسازی است. همچنین اغلب نیاز به کاربرد آنتی اکسیدانهایی شبیه سدیم دی اتیل دی تیوکاربامات(DIECA ) جهت خنثی کردن تشکیل پلی فنلها دارد. ریزپیوندی در این ویترو علاوه بر استفاد برای جوانسازی مریستمها، برای حذف ویروس از درختان نیز بکار برده شده است.

 جوان سازی این ویترو از طریق حذف نیمه رأسی هر دسته  برگ سوزنی روی ریزنمونه انجام شده است. قطعات ساقه با چنین نصف برگ سوزنی ه از Pseudotsuga menzieii جدا شده تعداد زیادی جوانه جانبی در این ویترو تشکیل دادند که بسیاری از آنها ریشه دار شدند. ریزنمونه هایی که از آنها برگهای سوزنی بطور کامل حذف شدند عکس العمل نداشتند. ساقه های ریزازدیادی Sequoia sepervirens پس از جداسازی مکرر بهتر ریشه دادند و واکشت جوانه های جانبی به دنبال جداسازی مکرر و واکشت مریستمهای انتهایی انجام شد نمو کشتها را گاهی می توان از طریق کشت کردن ریزنمونه به روی محیط القای کالوس( تمایززدایی) برای یک دوره کوتاه قبل از انتقال به محیط کشت القای ساقه بهبود بخشید سه ژئوتیپ Populus deltoids که از قبل با عنوان سرسخت مشخص شده بودند قبل از اینکه به محیط القای ساقه منتقل گردند. هنگامی که به مدت  1-8 روز روی محیط کشت حاوی  کشت شدند ساقه های نابجا تولید کردند. ترکیب آزمایشهای ریزازدیادی و به نژادی نشان داده است که ریخت زایی در این ویترو دارای جزء ژنتیکی است. به نژادی کلاسیک برای بهبود باززایی ساقه در این ویترو بوده است. تاکنون اطلاعات کمی درباره ژنهایی که ریخت زایی را در درختان کنترل می کند. در دسترس می باش. در یکی از آزمایشها دریافتیم که Larix decidua  بالغ به سادگی درشرایط این ویترو ساقه های نابجا تشکیل می دهد. در حالی که در Larix leptolepis چنین نیست. از طرف دیگر دورگ بین این دو به آسانی Larix decidua ساقه تولید کرد که این مطلب مؤید آن است که ظرفیت القای ساقه قابل توارث است و در دو رگ این صفت اساساً مربوط به والد L.decidua می باشد. همچنین مشخص شد که تفاوت های ژنتیکی قویی در کلونهای کالوس دو درخت بالغ Robinia pseudoacacia  وجود دارد. بدین معنی که کالوس حاصل از یک درخت همواره نسبت به کالوس درخت دیگر از لحاظ تکثیر ساقه نابجا و کنترل کننده ریخت زایی ممکن است تنظیم ژنی تولید هورمونهای داخلی را انجام دهند بعضی از محققان فیتوهورمونها به سلول های میزبان بتواند ظرفیت تشکیل ساقه کشتهای نامطلوب از نظر ریخت زایی را بهبود بخشد.

 5-4- اداره کشت پس از شروع رشد

5-4-1 رشد طولی ساقه های ریزازدیادی شده

رشد طولی ساقه های حاصل از ریزازدیاد شده اغلب دچار مشکل می شود این حالت به ویژه در زمانی که ریز نمونه ها از درختان بالغ گرفته می شوند وجود دارد. رشد طولی ساقه اغلب برای ریشه زایی ساقه ضروری است. ساقه های Pseudotsuga menzesii قبل از آنکه قابلیت ریشه زایی را بدست آورن حداقل به طول ساقه سه سانتیمتری نیاز دارد. ساقه هایی Larix decidua قبل از ریشه دار شدن لازم است به طول یک سانتیمتر برسند. البته ریشه زایی ساقه های حاصل از ریزازدیادی در visit notundifolia ارتباطی به رشد طولی ساقه نداشته است.

 در سونی برگها اغلب یک یا چند تغییر در محیط کشت پس از تشکیل ساقه و زمانی که رشد طولی ساقه آغاز می شود انجام  می گیرد. غلظت مواد معدنی به نصف کاهش می یابد. هورمونها حذف یا غلظت آنها کاهش می یابد. بعلاوه علظت ساکارز در محیط کشت اغلب کاهش می یابد. البته لازم است این کار با احتیاط انجام شود، زیرا غلظت کم ساکارز ممکن است سبب شیشه ای شدن شود. رشد طولی ساقه از تیمارهای انجام شده قبل از ساقه زایی تأثیر می پذیرد. رشد طولی ساقه های نابجا Pinus strobes  با غلظت های بالای BAP در محیط کشت طی القای ساقه کاهش یافت. از رشد طولی درکشتهای ساقه جانبیSequoia sempervirens 500 ساله با اکسین و سیتوکینین  حتی د رغلتظ های کم جلوگیری شد. این رشد با هر واکشت روی محیط کشت عاری از تنظیم کنندة رشد بتدریج بهبود یافت. زیادی نتیرات پتاسیم در محیط کشت سبب تحریک رشد طولی ساقه های حاصل از دستجات برگ سوزنی Pinus monticola شده است. غلظت کم 1% زغال فعلال به افزایش رشد طولی ساقه های نابجای Picea rubens انجامیده است. در حالیکه غلظت های بالاتر( 5/0 و 1%) سبب سوختگی برگ گردیده است. در این آزمایش اسید جیبریک بی اثر بوده است. پرتوتابی با نور قرمز دور به مدت دو هفته رشد طولی ساقه های نابجای Picea abies  را تحریک کرد.

 در کشت د رختان نهاندانه رشد طولی ساقه با یک دسته از تیمارها تحریک می شود کاهش Ph و افزایش کلسیم و منیزیم در محیط کشت رشد طولی در کشت های حاصل از گیاهچه های Castanca sativa تحریک گردید. کشتهای حاصل از درختان بالغ( به حد کافی رشد کرده قبل از آنکه رشد طولی اتفاق افتد به اکسین، آدنین، و زغال فعال در محیط کشت نیاز دارند. با جایگزین کردن فروکتوز به جای ساکارز در  محیط کشت رشد طولی ساقه بهبود بیشتری یافت. ساقه های ریزازدیادی حاصل از   

C.crenata × Castancea sativa بالغ کمتراز آنهایی که از گیاهان جوان بدست آمدند رشد طولی داشتند. رشد طولی روی محیط کشت MS با نصف غلظت نیترات بهتر از محیط کشت Lepoiver بود و BA د رمحیط کشت مانع آن بود. البته حذف کامل BA سبب سوختگی شد افزودن زغال فعاب به محیط کشت رشد طولی ساقه های Eucalyptus را در کشت تحریک کرد. رشد طولی ساقه Males domestica پس از چندین واکشت و زمانی که  و کینتین به جای BA درمحیط کشت تکثیر بکار رفت بهبود یافت. مه پاشی گیاهان دهنده ریزنمونه با BA یاGA می تواند رشد طولی ساقه های نابجایی را که بعداً تشکیل می شود کاهش دهد. این مورد برای ساقه های نابجای Plantanus orientalis و acerifolia × p. وجود داشت.

 5-4-2 شیشه ای شدن

شیشه ای دن یک مشکل عمومی در ریز ازدیادی است ویژگی آن با آبکی، نیمه شفاف و اغلب متورم شدن ساقه ها و برگهای گیاهچه مشخص می شود برگهای شیشه ای شده فاقد بافت است. اما در عوض دارای مزویل همراه با فضای بین سلولی بزرگ می باشد؛کوتیکول مومی که معمولاض بسیار نازک و اغلب روزنه کمتری وجود دارد بعلاوه بسیاری از روزنه های ممکن است به وظیفه خود عمل نکند. کاملاً قابل درک است که انتقال گیاهچه های شیشه ای شده از ظرف کشت به خاک اغلب مشکل است.

 کمترکردن تبخیر آب و میزان اتیلن در هوای بالای محیط کشت داخل ظرف اغلب شیشه ای شدن را کاهش می دهد همچنین این حالت از طریق کم کردن کلرید، آمونیوم و یا میزان تنظیم کننده رشد در محیط کشت به حداقل می رسد. شیشه ای شدن در ساقه های Larix decidua از طریق کمترکردن غلظت سیتوکینین، جایگزین کردن گلوتامین، نیترات کلسیم، یا افزودن ژلرایت به محیط کشت محتوی آگار کنترل شد است.دو تیمار اول تعداد ساقه های نابجا تشکیل شده را کا هش داد. ساقه های شیشه ای شده زمانی که به محیطی با نصف غلظت نیتروژن کل منتقل شوند به حالت معمولی برمی گردند.درصد ساقه های Pseudotsuga menziesii که شیشه ای شدند پس از چند واکشت به حداکثر رسید و در کشتهای بعدی کاهش یافت. افزایش غلظت آگار یا ژلرایت میزان شیشه ای شدن را در ساقه های نابجا Picea abies کاهش داد. اما این کاهش یا افت رشد ساقه و ریشه زایی همراه بود. بین سفتی آگار، شیشه ای شدن و کاهش میزان القای ساقه در کشتهای برگ سوزنی Picea sitchensis نیز همبستگی وجود داشت. شیشه ای شدن ساقه های Pinus canariensis روی محیط های کشت جامد شده با 8/0 ،9/0 یا 1%  آگار دیفکو- باکتو شدیدتر از 3/0، 4/0 یا 5/0 ژلرایت یا 8/0 یا 9/0 فیتاآگار بود.

 شیشه ای شدن می تواند در شدتهای مختلف اتفاق افتد. ساقه های به شدت شیشه ای شده Pinus radiate نیمه شفاف بودند در حالی که ساقه های سفید با سطح متوسط شیشه ای دارای ظاهری مرطوب است. ساقه های« مومی» معمولی به سادگی سازگار می شوند. تعدادی از ساقه های مرطوب که حالت شفافیت اولیه را پشت سر گذاشته بودند نیز بخوبی سازگار گردیدند.

 در میان نهاندانگان طیفی از عکس العمل های شیشه ای شدن وجود دارد. در کشتهای ساقه Castanea sativa محیط کشت MS با نصف غلظت معمولی نیترات بهترین محیط کشت واکشت برای رشد طولی ساقه و ریشه زایی بود. متأسفانه این محیط کشت شدیدتر از دیگر محیط های کشتهای آزمایش شده شیشه ای شدن را ایجاد نمود. شیشه ای شدن در کشتهای ساقه Prunus dulcis با جایگزین کردن فروکتوز به جای ساکارز در محیط کشت کاهش یافت. وزن خشک با فروکتوز به اندازه ساکارز افزایش یافت ولی جذب آب کاهش یافت. شیشه ای شدن ساقه های Malus domestica با افزایش غلظتهای آگار یا ژلرایت تقلیل یافت. همچنین غلظت زیاد آگار شیشه ای شدن را که در اثر غلظت زیاد BA ایجاد می شود کاهش داد. شیشه ای شدن با ژلرایت شدیدتر از آگار با همان سفتی بود. در برخی کشتها زمانی که از آگار استفاده می شود PH محیط کشت به مرور زمان به 4 افت خواهد کرد اما زمانی که ژلرایت به کار می رود نسبتاً ثابت خواهد بود. به نظر می رسدکه در برخی موارد برای اجتناب از شیشه ای شدن این موضوع باید مدنظر قرار بگیرد.

شیشه ای شدن همیشه دارای اثرات منفی نیست. در کشتهای شیشه ای شدة Picea sitchensis به ویژه کشتهایی که حداقل به مدت 24 روز در آب غوطه ور بوده اند جوانة بیشتری از آنهایی که شیشه ای نشده اند تشکیل گردید. وقتی آب محیط کشت کم می شود کشتهای شیشه ای شده به حالت نرمال باز می گردد.

5-4-3 ریشه زایی ساقه ها

ریشه زایی ساقه های نابجای گونه های چوبی توسط محققان متعددی مورد بررسی قرار گرفته است. ریشه زایی اغلب در این ویترو انجام می شود اما ریشه زایی در خاک استریل یا غیراستریل بیشتر متداول است. مزیت ریشه زایی در این ویترو این است که گیاهچه های عاری از آلودگی به دست می آید که اغلب می تواند بدون این که در معرض روشهای قرنطینه سخت گیرانه قرار گیرند به کشورهای دیگر ارسال شوند. البته ریشه زایی در این ویترو اغلب به نیروی کار بیشتری نسبت به ریشه زایی در خاک نیاز دارد و از کیفیت و سرعت کمتری برخوردار است. مشکل دیگر مربوط به ریشه های تشکیل شده در این ویترو این است که اغلب حذف کامل آگار چسبیده به آنها و انتقال به خاک بدون خسارت به آنها مشکل است. در مقایسة تشکیل ریشه در این ویترو و غیر این ویترو ریزقلمه های Acer rubrum، Betula nigra و Malus domestica نشان داد که ریشه های تولیده شده در این ویترو دارای سلولهای غشایی توسعه یافته ای بودند در حالی که در شرایط غیر این ویترو ریشه ها آناتومی نرمال تری داشتند.

ریشه زایی ساقه های حاصل از کشتهایی که از ریزنمونه های مواد گیاهی جوان ایجاد شده معمولاً مشکل نیست. در بیشتر موارد ریشه زایی یا به صورت خود به خودی یا پس از تیمار با یک اکسین انجام می شود. البته ریشه زایی زمانی مشکل تر است که از ریزنمونه های درختان بالغ استفاده شود. دلایل احتمالی برای این تفاوت فقط در برخی از موارد بررسی شده است. قلمه های درختان بالغ Castanea حاوی بازدارنده های ریشه زایی است که این عوامل در قلمه های حاصل از گیاهچه وجود ندارد. فقدان ریشه زایی در قلمه های ساقه در سوزنی برگهای پیرتر با تغییرات در متابولیسم کربوهیدرات در درختان کهنسال همراه است. ریشه را می توان مستقیم( بدون تشکیل پیش کالوس) یا غیرمستقیم ( رویش ریشه ها از کالوسهای زخمی) تولید کرد. قلمه های حاصل از هیپوکوتیلPinus controta به طور مستقیم ریشه زایی سریعتری از غیرمستقیم داشته اند. ساقه های جانبی Simmondsia chinensis در صورتی که به طور غیرمستقیم ریشه دار می شدند ریشه هایی با کیفیت ضعیف تولید می کردند.

5-4-3-1 ریشه زایی در این ویترو

عوامل فیزیکی و شیمیایی بسیاری وجود دارد که بر ریشه زایی در این ویترو اثر مطلوب دارند. بررسی اخیر بر تنش آب، دمای بالا، زغال فعال، اکسیژن و کاهش شدت نور به عنوان عوامل فیزیکی که ریشه زایی را تحریک می کنند تأکید دارد. محرکهای شیمیایی نظیر افزایش بر، کلسیم و منیزیم در محیط کشت است. همچنین ریشه زایی با برخی مواد فنولی و ویتامین D نیز تحریک می شود. برخی گونه ها با ساکارز بیشتر و بعضی با ساکارز کمتر در محیط کشت، ریشه بهتری می دهند. افزایش سطوح ساکارز، تشکیل لیگنین را تحریک و این خود، ریشه زایی راتسریع می کند. اکسینهای IBA و NAA به دلیل ناپایداری بعدی، اغلب مؤثرتر از IAA هستند. نسبت بالای اکسین به سیتوکینین برای انگیزش ریشه، ضروری است در حالی که سیتوکینین بازدارنده است. ویتامین D و اکسین با همدیگر اثر سینرژیک در تحریک ریشه زایی دارند. گاهی اوقات ریشه زایی از طریق افزایش میزان پوترسین[22] داخلی و از طریق کاهش PH محیط کشت تحریک می شود.

ساقه های نابجا و جانبی برخی گونه های کاج در صورتی که سیتوکینین در غلظت کم در محیط کشت موجود باشد بهتر ریشه می دهد. برتون و همکاران میزان تنظیم کننده های رشد درون زا در Sequoiadendron giganteum را طی ریشه زایی آن در این ویترو مطالعه کردند. آنها اعلام کردند زمانی که یک روش موفق ریشه زایی به کار می رود زنجیره ای از وقایع به صورت زیر اتفاق می افتد. پس از برش ساقه ها و انتقال آنها به محیط کشت القای ریشه، ساقه ها در موقعیت تنش قرار می گیرند که افزایش میزان ABA درون زا و ایزوپراکسیدازهای اسیدی منجر می گردد. به دلیل در معرض اکسینهای درونی قرار گرفتن، میزان ایزوپروکسیدازهای اولیه افزایش یافته که باعث از بین رفتن IAA درونی

---

[1] -Murashige and Skoog

[2] -Original media

[3] -Vitrification

[4] -Polyyurethane foams balls

[5] -chlormequant chloride

[6] -Fluridone

[7] -Phloridzin

[8] - Glycine betaine

9- افزونه یا Propagule به قسمتی از گیاه گفته می شود که برای ازدیاد آن به کار میرود.

[10] -Suspensor –like cells

[11] -encopsulated embryoids

[12] -Gresshoff and Doy(GD)

[13] -Pseudo - buds

[14] Fascicular

[15] -embryogenic calli

[16] -Suspensor

[17] -Proembryos

[18] -buthionine sulfoximine

[19] -Recalcirant species

[20] -stump sprout

[21] -Serial grafing

[22] - endogenous putrescine